使用色马格龙的超分辨率生物成像时代3D色变的高精度校正

马什珊瑚显微镜图像包含三维的色移。这损害了高分辨率图像的结肠化分析。通常很难去除源自生物样品本身的色移，我们的方法可以使用单独获得的参考图像来校正生物样品的色移。

演示程序将是高子库金从我的小组技术人员。首先在35毫米玻璃底盘上播种2.5倍至第五治疗细胞，并在二氧化碳培养箱中生长。24小时后孵育用PBS中3.7%甲醛的两毫升代替介质，轻轻混合。

在旋转平台上的室温下将销售固定 15 分钟。用两毫升PBS清洗细胞三次，5至10分钟。用两毫升点 1% 将它们渗透，在 PBS 中尝试下一个 100，同时旋转并使用 PBS 重复洗涤。

然后使用文本手稿中描述的标准抗体染色协议染色细胞。要获得宽场显微镜相声参考的参考图像，请添加两毫升点五微克每毫升Dappy留在DNA中。将电池留在旋转平台上 30 分钟。

然后用100微升的安装介质代替该溶液，获取用于任何类型的显微镜（包括共和和超分辨率显微镜）的生物校准参考参考图像。如前所述修复细胞，并准备在1.5毫升甲醇中结合荧光染料的荧光染料。将 phaloidin 添加到 PBS 中，Alexa 地板 405 1 至 1000 的稀释为 1 至 100，Alexa 地板 488 的稀释至 1 至 200 层，Alexa 地板 594 的稀释至 200 层。

将溶液的一毫升加入细胞，并在旋转时孵育30分钟。用两毫升PBS清洗细胞三到五次。然后用 100 微升安装介质更换 PBS。

要使用广场显微镜获取荧光图像，将目标样品放在成像软件的显微镜上，打开设计和运行实验窗口，设置相应的 Z 步长并选择蓝色、绿色和红色通道。在"运行"选项卡中，添加图像文件名并开始映像。要获取用于测量样品中色移的串扰参考图像，请选择仅针对 Dappy 的激发光，并确保使用与目标样品完全相同的阶段位置和 Z 高度。

或者，使用亮场图像作为宽场显微镜上目标样品的参考位置，并在蓝色、绿色和红色通道中获取目标的荧光图像。然后在同一阶段位置使用相同的 Z 高度，以蓝色、绿色和红色通道获取目标的明亮场图像。使用超分辨率显微镜获取荧光图像，如 3D Sim 将目标样品放在显微镜上，并在蓝色、绿色和红色通道中获取目标的荧光模拟图像。

然后重建超级解析图像。接下来，将多色 phaloidin 的样品污渍放在 3D sim 显微镜上。并在点级位置获取多个荧光模拟图像作为生物校准参考图像，然后重建超分路图像。

使用 Web 浏览器下载 Chromagnon 的最新二进制版本。提取程序，将可执行文件放在一个方便的位置。拖放串扰右场或生物校准引用到参考框的参考文件，或单击参考文件以打开文件选择器对话框。

如果程序要求安装 Java 开发工具包，请按"是"，然后导航到下载的页面。然后按照指示下载并安装操作系统的 JDK。在目标框中拖放抗体染色的目标文件。

选择输出图像格式并指定输出文件名的后缀。用于具有高信噪比的串扰参考图像。从局部对齐选项列表中选择投影，并使用最小窗口大小 60。

对于多个生物校准参考图像，请检查平均参考选项，然后选择无局部对齐，然后单击"全部运行"以开始测量。若要确保正确执行测量，请将参考图像拖放到参考框和目标框中。然后运行该程序并验证图像是否完全重叠。

可以使用串扰参考图像执行宽场显微镜中的色移校正。这张图片是通过配备单台相机的宽场显微镜获得的。Dappy 的荧光发射用作纠正蓝色、绿色和红色通道的参考。

与色度对准后，色度移位和参考图像得到校正。当对准参数被 Chromagnon 应用于目标图像时，DNA 和相位桥在核包络外部正确显示，然后对齐在包络内按预期显示。可以使用生物校准参考图像执行 3D SIM 图像的色移校正。

三个3D模拟图像的Hla细胞染色与 phaloidins 结合蓝色，绿色和红色染料被测试和色度移位测量。对齐后，色移和参考图像得到校正。对齐参数应用于目标图像。

XZ 视图显示沿 Z 和沿 X 方向稍微方向的通道位置不正确，在对齐后已更正。为了获得最佳性能，在相同的条件下获取参考图像和定时与目标图像相同非常重要。