光漂白可实现前列腺素球菌中 ftsz 环的超分辨率成像

该方法有助于回答蛋白质定位和光合作用生物动力学的关键问题。通过将光漂白方法与超分辨率显微镜相结合，我们能够显著地检测光合作用生物体的蛋白质动力学。这种方法不仅提供了对丙氯球菌蛋白质动力学的洞察。

它也可以适用于许多其他含有放射性-重唱和细菌叶绿素的生物体。演示这个程序的将是我实验室的研究生刘燕欣。首先，在培养瓶中加入五毫升的基于海水的Pro99介质，用一毫升的Pro氯球菌MED4进行接种。

在每平方米35微莫光子强度的光线下，在23摄氏度下生长丙氯球菌。五天后，将培养的一毫升收集到1.5毫升的管子中。在管子中加入100微升新鲜准备好的甲醛，以固定培养。

在室温下在黑暗中孵育20分钟。然后，在 13，500 次 G 下旋转样品一分钟。取出上一代，在Pro99介质的100微升中重新暂停细胞。

将样品储存在黑暗中四摄氏度，直到准备好进行免疫破坏。首先，涡流聚苯乙烯珠的小瓶。使用50%乙醇，准备一到2万稀释作为工作泥浆。

打开加热板，将温度设置为 120 摄氏度。接下来，将盖玻片放在热板上。将工作泥浆的 100 微升加载到每个盖玻片上，并在加热板上孵化盖玻片 10 分钟。

然后小心地将盖玻片转移到培养皿珠侧，在室温下存放。当准备涂上盖玻片时，取回一个，确保它是珠面向上。将每毫升聚L-莱辛溶液100微升添加到盖玻片的中心，让它在室温下坐30分钟。

在此之后，使用移液器小心吸气任何未连接的聚L-莱辛，并转移到1.5毫升管。将这种聚L-lysine储存在4摄氏度，供以后使用。在60毫米培养皿中用10毫升的超滤水冲洗盖玻片，然后用纸巾短暂干燥。

将涂层盖玻片转移到底部有 Parafilm 的新培养皿中，该盘将用作染色盘。将固定样品的 100 微升装到盖玻片上，让其坐 30 分钟，以便进行单元连接。接下来，使用纸巾吸收剩余的溶液，然后将盖玻片转移到12井板的井中清洗。

向井中加入一毫升 PBS 缓冲液以清洗盖玻片。然后取出 PBS 并添加一毫升新鲜 PBS 以重新清洗盖玻片。使用移液器取出 PBS，并将其替换为一毫升新鲜准备的渗透缓冲液。

在37摄氏度下孵育洗碗20分钟。然后删除渗透缓冲液。添加一毫升新鲜 PBS 缓冲液，开始洗涤过程。

将洗碗盘放在摇床上，轻轻搅拌五分钟。在此之后，取出 PBS 并重复洗涤过程三次。将洗净的盖玻片转移到染色盘上。

在盖玻片顶部添加 50 微升的阻塞缓冲器。将整个染色盘放在冰上，然后将放在 Xenon 光源下进行光漂白至少 60 分钟。光漂白和阻塞后，使用纸巾的边缘去除阻塞缓冲液。

首先，将一微升抗 FtsZ 抗体稀释成 99 微升的阻尼缓冲液。将稀释原抗体的50微升放在盖玻片上，并在室温下孵育30分钟。将盖玻片转移到洗碗的井上。

要开始洗涤，请加入一毫升 PBS。然后将洗碗盘转移到摇床中，轻轻摇动五分钟。取出 PBS 并重复整个洗涤过程三次。

接下来，将盖玻片转移到染色盘。将稀释的二次抗体的50微升放在盖玻片上，在黑暗中和室温下孵育30分钟。将盖玻片转回洗碗盘。

要开始洗涤，请加入一毫升 PBS。用铝箔包裹洗涤盘，防止其光线。将板转移到摇床，轻轻摇动五分钟。

取出 PBS 并重复整个洗涤过程三次。在 STORM 成像之前，请准备文本协议中概述的一毫升成像缓冲区。将盖玻片装入装料室。

加入新鲜准备好的成像缓冲液，温和地避免洗掉蓝藻细胞。在此之后，在成像缓冲器顶部放置一个矩形盖玻片，以防止其与空气中的氧气发生反应。打开相机、LED 灯和激光，然后打开 STORM 软件。

在镜头顶部加入半滴浸入油。加载腔室，确保目标镜头与盖玻片接触。用750纳米激光检查信号。

确定包含单元格和基准标记的样本区域。然后启动用于样品漂移校正的软件。获取一个宽图图像作为参考，相机电子乘法增益为300，曝光时间为30毫秒。

将 750 纳米激励激光强度增加到每平方厘米约 4.5 千瓦。一旦荧光团过渡到稀疏的闪烁模式，通过收集1万帧33赫兹，获得一个超分辨率的图像。然后从文本协议中概述的原始数据重建超分辨率图像。

在这项研究中，STORM通过随机激活单个光可切换荧光团来实现超分辨率成像。记录每个荧光团的位置，然后根据这些位置构建一个超分辨率图像。虽然Prochlorococcus的吸收光谱达到447和680纳米的峰值，最小吸收量超过700纳米，但Prochlorococcus MED4细胞在暴露于750纳米激光器的极高强度时仍会发出高自荧光，这是STRAM成像所需的极强强度。

使用此处描述的光漂白方法30分钟后，细胞的自荧光量会减少，尽管仍然检测到几个具有自荧光的细胞。将光漂白时间拉长至60分钟会导致大多数细胞失去自荧光。结果表明，研制的光漂白法能够大大减少光合生物的自荧光。

光漂白后，STORM用于可视化细胞中的细胞分裂蛋白FtSZ。使用 STORM，可以揭示 FtsZ 环的详细形态。通过旋转 3D STORM 图像，确定了四种不同类型的形态、聚类、不完整的环、完整的环和双环。

重要的是要记住，光漂白的光强度和持续时间可能因不同的生物体而不同。该方法开发后，为研究光合作用细胞中的蛋白质组织和潜在功能的研究人员铺平了道路。