具有蓝色和红移通道性通道性神经元的长距离通道多普辛辅助电路映射

通道辅助电路映射是远程神经投影功能映射的精密技术。在这里，我们展示如何使用这种方法来研究听觉脑干中的电路。在大脑切片中，来自多个来源的轴子经常被混合，因此很难使用电刺激来分离单个输入。

通过使用 CRACM，可以克服此限制。查找 lambda 并持续定义立体税坐标系是具有挑战性的，因为保持程序的持续时间很短。仔细规划所有步骤将提高您的成功率。

首先用70%乙醇喷洒手术区，对无菌毛巾窗帘进行消毒，并放置无菌毛巾窗帘覆盖手术区域。取出笼子床上用品，以限制从回收笼中窒息的风险。接下来，在笼子下放一个加热垫，提供食物和水源。

接下来，将动物转移到立体轴框架，并继续麻醉。插入直肠温度探头并打开恒下温度控制器。然后，涂抹眼科软膏，防止眼睛干涸。

管理先发制人镇痛剂。最后，用电动剪子剃头皮。用三个交替拭子的波维酮碘和70%乙醇消毒头皮。

开始手术，沿着中线在头皮上切口，从耳朵和眼睛的继续肩体开始，露出羊羔和白细胞缝合线。如有必要，将皮肤推到一侧，并去除外露骨骼的周分。接下来，用手术标记标记羔羊缝合线，定位纳米注射器的尖端，以便它只需触摸 lambda，将微操纵器坐标归零。

使用纳米喷油器尖端和微操纵器测量羊舌和啤酒缝合线之间的高程差。调整调色板栏高度，使兰巴达和布雷格玛在正负 100 微米高度差内。使用纳米喷油器尖端和微操纵器坐标系映射注射部位，并使用手术标记标记注射部位。

然后，使用带 0.5 毫米钻孔的微电机钻头对注射部位进行颅骨切除术。为了确保目标核中神经元的广泛转染，使用纳米喷油器在组织的不同深度和较大的大脑区域（如低劣的合体）进行注射，在两个或两个或更多穿透过程中在不同的X和Y坐标进行注射。注入劣质胶质，在2，250微米和1，750微米深度之间的Z轴上，在250微米的间隔内沉积20纳米的病毒。

在背耳蜗核中注射时，分别沉积20纳米病毒，深度为4，750微米和4，550微米。在每个 Z 坐标处注射后，等待两到三分钟，然后将喷油器移动到下一个 Z 坐标，以便让病毒从注射部位扩散出去，从而降低在重新定位纳米喷油器时病毒被吸进注射区的可能性。然后，在上次注射后，等待三到五分钟，然后从大脑中收回纳米注射器。

当纳米注射器从大脑的渗透和动物之间取出时，从尖端中弹出少量病毒，检查尖端是否堵塞。注射后，使用无菌PBS弄湿头皮的切边，然后轻轻地将皮肤移回中线。用6-0尼龙缝合线用简单的中断缝合线关闭伤口。

然后，在伤口上涂抹0.5至1毫升2%利多卡因果冻。拆下耳杆和温度探针，转动异氟，然后将动物从调色板栏中取出，并将其转移到恢复笼中。最后，密切监视恢复情况。

一旦动物完全清醒，四处走动，没有疼痛或痛苦的迹象，把它放回笼子里，然后把笼子放回笼子里。使用标准补丁夹法进行录制。首先将切片放在固定阶段直立显微镜下的录音室中，并持续以每分钟两毫升的速度用人工脑脊液进行大量处理。

接下来，使用合适的贴片夹放大器在视觉控制下对神经元进行修补。最后，在批发录音过程中，通过 580 纳米光的短暂脉冲通过市售 LED 提供 470 纳米光或 ChrimsonR 的短暂脉冲，激活 Chronos。结果表明，ChrimsonR注射导致DCN的强烈表达，在细胞和纤维中可见tdTomato荧光。

在相反的 ICC 中，三周后，用 tdTomato 强烈标记的纤维清晰可见，这显示了 ChrimsonR-tdTomato 结构在注入听觉脑干核时的长期贩运能力。IC VIP神经元中ChrimsonR的光学激活，表明当实验参数需要使用红灯而不是蓝光时，ChrimsonR是远程CRACM实验的有用工具。然而，我们发现，ChrimsonR 很容易用蓝光激活，显示与 Chronos 相同的蓝光激活阈值。

对于此协议，最重要的是确保立体轴坐标正确，并确认病毒仅在目标大脑区域表示。通过用不同的病毒（例如，细胞特异性Flex病毒）交换Chronos ChrimsonR viro构造，您可以回答几个解剖或生理问题，而无需改变手术方案。