使用 PRESTO-Tango Assay 在 GPCR-宽范围范围内对 β-Arrestin2 进行配制筛查的平行审讯

Presto-Tango平台旨在对人类基因组中所有非植物GPCRs进行平行和同时的审讯，包括将2个招募中配体诱导的β-逮捕的孤立目标剖面。Presto-Tango 平台是使用 G 蛋白独立 β-arrestin 招募检测以并行方法分析整个 GPCR 基因组的唯一开源资源。演示处理器的将是吉纳维夫·拉罗什，我实验室的研究员，以及我实验室的博士生马内尔·齐加尔。

在开始手术之前，将每毫升聚L-莱辛溶液20微升添加到384个光学底板的适当实验编号的每个孔中，并在室温下孵育板30分钟至两个小时。在孵育结束时，在水槽上轻拂板，去除多余的聚L-lysine，并在每孔中加入40微升抗生素抗霉菌溶液。然后在37摄氏度下孵育细胞种子所需的板，将其余板放在4摄氏度，以长期储存。

要播种HTLA细胞进行初级筛选，在每盘用6毫升0.05%的三丁鱼EDTA治疗培养物之前，用10毫升PBS轻轻冲洗150毫米细胞培养物。当细胞分离池时，细胞悬浮在含有相同容积的50毫升圆锥管中。通过离心收集细胞。

每毫升DMEM浓度的2.2倍至第5个细胞重新悬浮颗粒，并在水槽上轻拂板，以去除抗生素抗霉菌溶液。敲击板干燥，将45微升的细胞播种到每口井中。然后将板在37摄氏度和45%的二氧化碳过夜。

为了准备384井DNA源板的转染分配50毫微克每毫升每个质粒免费DNA编码GPRC探戈结构感兴趣的0.1X三叶-EDTA每个井到96井板的每一个井。使用多通道移液器，将 96 孔板的每个孔的 10 微升 DNA 溶液手动转移到 384 孔 DNA 源板的单个孔中，每个条件都使用四重奏，如图所示。接下来，将 0.313 摩尔氯化钙溶液的 40 微升转移到 DNA 源板的每个井中，轻轻混合每个井的含量。

将 50 微升 2 倍 HEPES 缓冲液加入 384 井 DNA 源板的每个井中，轻轻混合。一分钟后，将10微升的DNA转染混合物从384井DNA源板转移到每个种子HTLA细胞的井中，并孵育细胞培养箱中的细胞过夜。第二天，将转染细胞培养，慢慢将40微升的饥饿介质添加到每井中，注意不要直接接触细胞。

然后将20微升的车辆缓冲液加入，用于在20微升的复合物中，在20微升的复合物中，以三倍浓度将交替行，然后将板返回细胞培养箱。刺激后16至24小时，将转染细胞培养棒化，并在每井中加入20微升新鲜准备的发光试剂，在室温下孵育5至20分钟，不受光线影响。然后读取微板发光计数器上的板，每孔一秒的集成时间。

对于二次筛选，将 100 毫米培养皿中的 HTLA 细胞以 5 倍 10 到 6 个细胞的总细胞密度，每盘 11 毫米完整介质，在 37 摄氏度下 24 小时进行。第二天，将10微克GPCR免费DNA与500微升的Tris-EDTA氯化钙溶液与涡流混合，然后加入500微升的 HEPES 缓冲液。剧烈摇晃后，在室温下孵育溶液一分钟，并立即将溶液的一毫升滴到细胞上。

轻轻岩石均匀分布沉淀物，并将板在 37 摄氏度下放置 24 小时。第二天，检查荧光细胞成像器下的转染效率。超过 50% 覆盖率的交易是理想的交易。

用三毫升0.05%的三叶草EDTA分离细胞之前，用诗句溶液轻轻冲洗转染细胞。通过离心收集分离的细胞，并在每毫升饥饿的中等浓度的四倍十至五分之五的细胞中重新悬浮颗粒。然后将45微升细胞种子播种到多L-lysine编码的384井板的每个井中，并在细胞培养培养箱中放置该板至少4小时。

准备半日志剂量曲线响应板添加270微升HPSS补充HPES和抗生素抗霉菌到所有，但最后一行96井板，并添加30微升的每个高和低药物溶液到行H.转移溶液从每一行H到相应的井的行G混合，并继续连续稀释药物化合物，直到最后一行的板到达。使用原理图作为参考，将 96 孔板的 A 行至 G 行中的 20 微升低柱稀释液和高柱稀释的 20 微升混合到 96 孔板的 B 至 H 孔中，以先前坐落的 384 孔板。然后在37摄氏度下孵育板，至少16小时。

刺激后16至24小时，将转染细胞培养试剂化，并在每孔中加入20微升发光试剂，孵育5至20分钟，然后读取微板发光计数器上的板，每次孔的整合时间为1秒。在这个具有代表性的实验中，在初级筛查中被询问的168个GPCR中，只有多巴胺受体D3和opsin5是作为潜在活动目标的竞争者。多巴胺受体D3产生4.7的日志2折叠变化，而opsin5产生2.39的轻微低反应。

相比之下，多巴胺受体D2，对主屏的正对照产生了4.58的对数2折变化。来自二次筛选的这些反应曲线表明，染色质颗粒提取物产生的信号窗口在一半最大有效浓度值中达到五皮醇，以确认其作为多巴胺受体D3的主动打击的有效性。一个类似于阴性对照的平面剂量曲线被生产给opsin5，但是排除了这种受体作为染色质颗粒提取物的可能靶点。前探戈需要特别小心，因为细胞分布、转染效率和连续药物稀释的变异性可能导致复合误差，从而影响数据的准确性。

正交方法，如放射性结合方法，生物发光共振能量转移和循环AMP钙和内化功能测定可用于进一步确认和描述配体受体相互作用。