高通量筛选钙荧光双重加成测定允许鉴定通过细胞内钙级联反应发出信号的 G 蛋白偶联受体的新型小分子配体。双重加成测定的主要优点是在单次测定中检测激动剂和拮抗剂HTS，只要荧光信号持续两分钟，相同的细胞。该方法可以应用于任何通过钙级联发出信号的GPCR，其中包括大多数节肢动物神经元肽家族，即GPCR。
对于测定的重现性，重要的是优化第二版已知激动剂的细胞密度、注射速度和浓度。演示该程序的将是我实验室的博士后研究助理Bianca Henriques-Santos。通过从含有70至90%汇合BMLK三个细胞的T-75烧瓶中取出用过的培养基来开始钙荧光测定。
用10毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS洗涤细胞。取出DPBS后，使用两毫升0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸或EDTA分离细胞，并在37摄氏度下孵育三至五分钟。加入8毫升选择性培养基，并将细胞悬液转移到15毫升锥形管中。
在以1000×g离心细胞悬液三分钟之前。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于含有1%胎牛血清或FBS和每毫升400微克G418硫酸盐的10毫升F-12K培养基中。为了确定悬浮液的细胞密度以进一步稀释，将20微升细胞悬液混合到20微升0.4%台盼蓝中，然后将20微升混合物装入细胞计数室中，由细胞计数器读取细胞密度。
使用相同的F-12K培养基稀释细胞悬液，并以密度为每毫升10至第五个细胞的四倍将最终体积补足至15毫升。将细胞接种在Poly-D赖氨酸或PDL编码的384孔板中。使用液体处理系统将25微升稀释的细胞悬液添加到板的384孔中。
将板在37摄氏度和5%二氧化碳下在加湿培养箱中孵育过夜。第二天，快速倒置90%汇合的384孔板。除去用过的培养基，并在无菌纸巾上轻轻吸干两到三次，以从盘子中取出所有液体。
在生物安全柜内柔和昏暗的光线下执行后续步骤。接下来，使用液体处理系统将 25 微升上样染料添加到每个孔中，方法是以每秒 3.8 微升的吸液和分液速度将 12.5 微升分液到每个孔中。重复此移液步骤，以达到每个孔中25微升的最终体积。
完成后，用铝箔盖住板以保护其免受环境光照射，并在二氧化碳加湿培养箱中以 37 摄氏度孵育 30 分钟。将覆盖的板再平衡30分钟后，细胞即可进行高通量筛选或HTS。接下来，将药物板在平板离心机中以1200×g离心一分钟。
将Rhimi-K-1的10x激动剂肽溶液转移到150毫升自动友好型储液器中。在酶标仪中，单击管理实验方案。然后在终点荧光强度协议中，选择Flow Forte预读，单击开始测量以测量整个HTS测定的背景信号。
将细胞板插入读板器。在仪表板中，单击板上的随机孔，然后单击新的对焦高度。单击焦点调整。
单击增益调整。将其指定为最大可测量荧光值的5%至10%。单击开始调整。
单击开始测量以读取整个板的背景荧光信号（以相对荧光单位或 RFU）为单位。在板读数时，单击当前状态以查看实时读数值。对于双重添加测定，使用液体处理系统上下移取10微升药物溶液三次，并以每秒1.0微升的吸吸速度从药板的每个孔中吸出1.5微升。
将0.5微升化合物分配到细胞测定中，以达到0.2%二甲基亚砜或DMSO中两微摩尔的最终浓度。加入筛选化合物后，立即将测定板放入酶标仪中。单击预设读取程序，沿正向和反向读取方向读取板。
通过将吸头浸入含有约50毫升DPBS的150毫升废物储液罐中，处理吸头中残留的一微升药物溶液。将筛选化合物与细胞一起孵育总共五分钟，包括在生物安全柜中的读板器内熄灯的时间。接下来，使用液体处理系统使用384 12.5微升吸头将三微升激动剂肽Rhimi-K-1从储液器中加入分析板。
立即将板放入读板器中。单击预设读取程序，沿正向和反向读取方向读取板。一旦完成，手动计算每个板测定质量控制的Z'因子。
从在线HTS数据平台上的热图中手动选择命中分子，并计算标准化的活化百分比或NPA和抑制活性，或激动剂命中和拮抗剂命中的I0。由320个随机小分子组成的内部药物板SAC2-34-6170用于演示该HTS测定。HTS具有出色的检测质量，Z'因子为0.7，反映出检测质量与测试化合物无关。
添加激动剂后立即读取板至关重要，因为荧光信号是短暂的。在此过程之后，应通过剂量反应测定验证已鉴定的命中分子，并在不表达靶GPCR的细胞中进行测试，以排除脱靶命中。
