监测GPCR-β-阻丁1/2实时生命系统中的相互作用,加速药物发现

该协议在药物发现和开发领域具有很高的影响，特别是在开发具有最小副作用的新颖、一流的药物方面。该技术的主要优点是可应用于任何GPCR系统，并用于获取实时生活系统中受体药理学的准确信息。这项技术的含义与新疗法密切相关，特别是在β-卡贝因相关方面。

这些包括疼痛中的蛋白石受体和精神分裂症中的多巴胺受体。该方法在神经病、心肺病等许多医学科学研究领域都很有用。PCR 演示我们的方法非常重要，因为它允许详细介绍协议中的关键步骤，而传统发布则无法实现这一点。

首先设计底图，将感兴趣的基因引入pBIT向量。由于划分多克隆位点的 inframe stop codon，因此在三个站点中选择至少一个作为定向克隆所需的两种唯一限制酶之一。有关核苷酸序列的手稿，请对链接器残留物进行编码，并将其合并到底原上。

对于 pBIT1.1-C 和 pBIT2.1-C，确保正向底转包含 ATG codon 和强大的 Kozak 共识序列。对于 pBIT1.1-N 和 pBIT2.1-N，请确保反向底法包含止损胶。使用设计底图放大感兴趣的基因的插入DNA。

根据手稿方向组合 PCR 试剂，确保使用高保真 DNA 聚合酶以最大限度地减少突变。对热循环器进行编程并开始反应。完成PCR后，在50微升消化反应中消化产品。

在1.5毫升管中，组合12微升蒸馏水、5微升适当的10X限制消化缓冲液和30微升PCR产品。然后加入每个限制酶的1.5微升。漩涡反应混合物。

并在37.5摄氏度过夜孵育。准备第二反应来消化接受者质粒。在1.5毫升管中，结合23微升水、5微升适当的10X限制消化缓冲液、15微升的受助质粒和1.5微升的每个限制性酶。

将管子简单混合。并在37.5摄氏度过夜孵育。在克隆和转化的第二天，选择3到10个单独的细菌菌落，并把它们转移到一毫升的LB培养基与安皮西林。

孵育细胞6小时。然后将 200 微升的细菌悬浮液转移到 5 毫升的新鲜 LB 介质中，并使用安霉素。在 37.5 摄氏度下孵育培养，在 200 rpm 下一夜摇晃。

第二天，用微型预制备DNA纯化试剂盒分离质粒。筛选纯化质粒，成功使用 PCR 进行连接。转染前一天，使用Dulbecco改良的鹰的介质在涂有96井的聚L-lysine板上播种细胞，并辅以10%的胎儿牛血清、每毫升青霉素G100个单位和每毫升链霉素100微升。

仅向 60 个内孔添加细胞，以最大限度地减少整个板的热梯度和蒸发产生的边缘效应。在36口井中加入200微升无菌蒸馏水，在井之间的空间中加入150微升。然后在37.5摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板。

第二天，使用总共100纳米DNA进行转染。根据手稿方向设置四种不同的质粒组合。使用 20 微升的改性 Eagle 最低基本介质缓冲与 HEPES，以及每井 0.3 微升脂质转染试剂。

在每个井中加入20微升脂质转染试剂和DNA混合物，将板在圆中混合10秒。在37.5摄氏度和5%的二氧化碳下孵育6小时。刷新介质。

再孵育24小时孵育后，吸气介质，并添加100微升的修改鹰的最低基本介质缓冲与 HEPES 到每一个井。让板在室温下稳定 10 分钟。

同时，通过将100X基板的一体积与19卷LSS稀释缓冲液相结合，准备毛茸茸基材，形成5倍的基材，与细胞培养基混合。当细胞准备就绪时，将25微升的库存添加到每个井中，轻轻混合板10秒钟。然后在室温下测量发光10分钟，以稳定信号。

对于配体加法的实验，在经过修改的 Eagle 使用 HEPES 缓冲的最小基本介质中准备 13.5 倍配体解决方案，并使用多通道移液器每井添加 10 微升。然后用手或轨道摇床混合板。该协议已成功用于研究原型 GPCR 和两个 β-逮捕素等同项形式之间的相互作用。

筛选出四种不同的质粒组合，并选择了发光信号最高的质粒组合进行进一步实验。每种β-阻滞素等等物的EC50值都是使用剂量-反应曲线确定的，这些曲线是从动力学研究中每个浓度的最大反应中获得的。在设计 PCR 底件时，要特别注意这一点至关重要。

正确的结构的发展对于这些测定的成功至关重要。按照这种方法，您将能够监测受体-β-卡丁蛋白的相互作用，以及受体与其他细胞蛋白的相互作用。这种方法将有助于回答GPCR药理学领域的基本问题，通过研究GPCR-β-阻滞剂相互作用如何通过改变配体结构来调节。