共培养实验的奥里戈丁细胞和奥里戈丁酸基质的生成

我们描述了一种有效的寡头代细胞纯化和培养方法。这允许解决分子机制控制寡头细胞分化及其与神经元在脑质过程中相互作用的问题。这种摇动技术并不昂贵，是获得高量的橄榄细胞的最佳方法。

这种文化允许产生橄榄细胞条件介质和与神经元的寡头细胞共培养物。多发性硬化症是一种由中枢神经系统的聚焦性脱毛引起的疾病，继发于奥利戈登德细胞丧失。Oligodendrocys 文化为更好地了解如何促进再核化提供了工具。

只有寡头细胞培养才能提供对控制寡头细胞发育和生物学的内在机制的见解。与神经元的共培养可以深入了解它们对神经元生理的影响。首先，使用弯曲钳子将动物的头部保持在眼睛水平。

使用小手术剪刀在头骨底部做一个小切口，并在大脑中线后切割头骨。使用钳子轻轻地从中线剥离头骨的两个部分。使用小手术勺将大脑从头腔中取出。

将大脑放入含有冰冷PBS葡萄糖的60毫米培养皿中。在立体显微镜下观察，使用细钳从脑半球取出小脑、脑干和嗅球。使用细钳分离两个脑半球。

使用精细钳子剥下毛细。将脑皮质放入60毫米的培养皿中。在层流罩中，使用锋利的手术刀精细地切除了脑皮质。

将切碎的组织转移到含有酶消化介质的50毫升管中。在37摄氏度的加湿孵化器中孵育30分钟，低于5%的二氧化碳。之后，使用移液器轻轻去除酶消化介质，同时确保皮质组织留在管的底部。

使用P1000微管加入一毫升DMEM 10%胎儿小牛血清，轻轻三角组织。使用 70 微米过滤器和一毫升注射器的活塞将皮质组织过滤到 50 毫升管中。用DMEM 10%胎儿小腿血清多次冲洗50毫升管内管壁上的残余组织。

用DMEM 10%胎儿小腿血清填充50毫升管。在室温下以423倍g离心5分钟。小心地取出上一提液，用两毫升DMEM 10%胎儿小牛血清重新暂停细胞颗粒。

用P1000微移子轻轻三分细胞颗粒，然后用P200微移管轻轻三分。用适当的DMEM 10%胎儿小牛血清稀释细胞悬浮液。T-150烧瓶上细胞悬浮液的五毫升，密度为每平方厘米10至第5个细胞的1倍。

在每个T-150烧瓶中加入20毫升温暖的DMEM 10%胎儿小牛血清。在37摄氏度的加湿孵化器中孵育，二氧化碳含量低于5%。在250转/小时和37摄氏度的温度下隔夜摇动样品后，在烧瓶中收获上一个上经剂，其中含有主要为橄榄细胞的谱体，还有一些微胶质细胞，并把它盘放在非涂层的100毫米培养皿上。

在37摄氏度的加湿培养箱中孵育培养培养皿15分钟，并吸收5%的二氧化碳。这允许通过微差快速粘附在菜盘表面去除微胶质细胞。同时，在每个T-150烧瓶中填充25毫升温暖、新鲜准备的培养基，并在37摄氏度的加湿培养箱中孵育，温度低于5%的二氧化碳，直到第二次震动。

接下来，将上清液从培养皿转移到新的非涂层100毫米培养皿中，以附着残余微胶质细胞。在37摄氏度的加湿培养箱中孵育培养培养皿15分钟，浓度低于5%二氧化碳。从每两个培养皿中去除上一个上因，其中含有非粘附的寡头细胞血统细胞，并将其转移到50毫升管中。

丢弃镀有微胶质的培养皿。在423倍g下离心管5分钟。小心地取出上一提液，用一毫升的博滕斯坦-佐藤培养重新灌装细胞颗粒。

将所有颗粒混合在一个常见的50毫升管中，根据细胞密度与博滕斯坦-佐藤介质将体积调整为20或30毫升。板二或三个预涂100毫米培养皿与10毫升的细胞悬浮液。在37摄氏度的加湿孵化器中孵育，二氧化碳含量低于5%。

两小时后，通过刷新所有博滕斯坦-佐藤介质，清除培养皿中的碎屑。在37摄氏度以下的5%二氧化碳下，在加湿的培养箱中孵育两天。两天后，在显微镜下检查文化。

在层流罩中，在无菌条件下，使用 10 毫升暖 MPB-27 低介质更新培养培养介质。在37摄氏度的加湿孵化器中孵育两天，在5%的二氧化碳以下。要收获OCM，收集含有橄榄细胞分泌因子的上继物质。

使用 0.22 微米过滤器对 OCM 进行灭菌。在该协议中，通过摇动星细胞和微胶质，从胶质培养物中纯化了寡头细胞谱谱细胞。对不同标记的表达分析表明，奥利神细胞培养多为前，O4阳性细胞为90正负4%，85正细胞为负7%NG2阳性细胞，4.7正细胞为4.7正细胞，7.2正细胞为2.5%，而7.2正细胞为G进细胞阳性。

从这些培养物中产生的OCM在体外三天内被添加到纯化的海马神经元培养物中。这种治疗促进非蛋白质的聚类。通过14天体外添加寡分球菌，研究了海马神经元的脑质化。

从体外20天到24天，对米林标记物（如米林基本蛋白）的免疫染色，允许对兰维尔的米林段和节点进行可视化。核心 PBS 对于去除毛丁苯十一种非常重要。快速清除对于寡头的生存能力和实现与移液器应用的流动强度至关重要。

可将寡细胞化条件培养素添加到神经元培养中，以深入了解寡细胞分泌因子对神经元生理学的影响。也可以进行寡头与神经元的共培养，以研究脑体化过程。