Мы описываем эффективный метод очищения и культуры олигодендроглиальных клеток линии. Это позволяет решать молекулярные механизмы, контролирующие дифференциацию олигодендроцитов и их взаимодействие с нейронами в процессе миелинизации. Этот метод встряхивания не является дорогостоящим и является оптимальным для получения большого количества олигодендроцитов.
Такие культуры позволяют выпроизводства олигодендроцитов состоянии среды и совместно культур олигодендроцитов с нейронами. Рассеянный склероз является заболеванием, вызванным очагом демиелинизации в центральной нервной системе, вторичным по отношению к потере олигодендроцитов. Культура олигодендроцитов обеспечивает инструмент для лучшего понимания того, как способствовать повторной миелинизации.
Только олигодендроглиальная культура клеток может дать представление о внутренних механизмах, регулирующих развитие и биологию олигодендроцитов. Со-культуры с нейронами позволяют получить представление об их воздействии на физиологию нейронов. Для начала используйте изогнутые типсы для поддержания головы животного на уровне глаз.
Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез у основания черепа и вырезать череп после средней линии мозга. Используйте типсы, чтобы аккуратно очистить две части черепа от средней линии. Используйте небольшую хирургическую ложку, чтобы удалить мозг из полости головы.
Положите мозг в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую ледяную глюкозу PBS на льду. Просмотр под стерео микроскопом, использовать тонкие миппы для удаления мозжечка, ствола мозга, и обонятельные лампы из полушарий головного мозга. Используйте тонкие типсы, чтобы отделить два полушария головного мозга.
Используйте тонкие типсы, чтобы снять менинги. Положите мозговые кортики в 60-миллиметровую чашку Петри на лед. В ламинарном капюшоне используйте острый скальпель, чтобы мелко нарезать мозговые кортисы.
Перенесите рубленую ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую среду пищеварения ферментов. Инкубировать в течение 30 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После этого используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить среду пищеварения фермента, убедившись, что корковая ткань остается в нижней части трубки.
Используйте микропипют P1000, чтобы добавить один миллилитр DMEM 10%fetal икроножной сыворотки и аккуратно тритурировать ткани. Используйте 70-микрон-фильтр и поршень одного миллилитрового шприца для фильтрации корковой ткани в 50-миллилитровую трубку. Промыть остаточную ткань на внутренней стенке трубки 50-миллилитровой трубки несколько раз с DMEM 10%fetal теленка сыворотки.
Заполните 50-миллилитровую трубку сывороткой DMEM 10%fetal calf. Центрифуга при 423 раза г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы двумя миллилитров сыворотки DMEM 10%fetal calf.
Аккуратно тритурировать клеточные гранулы с помощью микропипетта P1000, а затем, с помощью микропипеда P200. Разбавить клеточной суспензией с соответствующим объемом DMEM 10%fetal икроножной сыворотки. Плита пять миллилитров клеточной подвески на колбе Т-150 при плотности от 1 раза от 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр.
Добавьте 20 миллилитров теплой сыворотки для теленка DMEM 10%fetal в каждую колбу Т-150. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. После встряхивания образца на ночь при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию, урожай супернатанта в колбе, содержащей в основном олигодендроцитов линии клеток, но и, некоторые микроглиальные клетки, и пластины его на не покрытой покрытием 100-миллиметровые чашки Петри.
Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Это позволяет удалить микроглиальные клетки через дифференциальную быструю адгезию на поверхности тарелки. В то же время, заполнить каждый Т-150 колбу с 25 миллилитров теплой, свежеприготовленной культуры среды и инкубировать во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию под 5%углекислого газа до второй тряски.
Затем перенесите супернатант из чаши Петри в новые 100-миллиметровые чашки Петри, не покрытые покрытием, чтобы позволить ссадить остаточные микроглиальные клетки. Инкубировать чашки Петри в течение 15 минут во влажном инкубаторе при 37 по Цельсию под 5%углекислого газа. Удалите супернатант из каждых двух блюд Петри, которые содержат непритятарные клетки линии олигодендроцитов, и перенесите его в 50-миллилитровую трубку.
Откажитесь от блюд Петри, помояемых микроглией. Центрифуга труб в течение пяти минут при 423 раза г. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы одним миллилитром среды Боттенштейн-Сато.
Бассейн все гранулы в общей 50-миллилитровой трубки и настроить объем до 20 или 30 миллилитров в зависимости от плотности клеток с Bottenstein-Сато среды. Плита два или три предварительно покрытием 100-миллиметровые чашки Петри с 10 миллилитров клеточной подвески. Инкубация во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом.
Два часа спустя, очистить мусор от чаши Петри, освежив все Bottenstein-Сато среды. Инкубировать в течение двух дней в среде во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Через два дня изучите культуру под микроскопом.
В ламинарном капюшоне потока, в стерильных условиях, обновить культурную среду с 10 миллилитров теплой МПБ-27 низкой среды. Инкубировать в течение двух дней во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислым газом. Чтобы собрать OCM, собрать супернатант, содержащий олигодендроциты выделяется факторов.
Фильтр стерилизовать OCM с помощью фильтра 0,22 микрон. В этом протоколе клетки линии олигодендроцитов были очищены от глиальных культур, стряхивая астроциты и микроглии. Анализ экспрессии различных маркеров показал, что культуры олигодендроцитов были в основном доолигодендроцитами с 90 плюс-минус 4% положительных клеток O4, 85 плюс-минус 7%NG2 положительных клеток и 4,7 плюс-минус 2,1% положительных клеток ПЛП, в то время как 7,2 плюс-минус 2,5% клеток были положительными астроцитами GFAP.
OCM производства из таких культур были добавлены в течение трех дней в пробирке для очищения гиппокампа нейронных культур. Это лечение способствует кластеризации нотальных белков. Миелинизация гиппокампа нейронов были изучены путем добавления олигодендроктии на 14 дней в пробирке.
От 20 до 24 дней in vitro, иммуноокрашивание маркеров миелина, таких как основной белок миелина, позволило визуализировать сегменты миелина и узлы Ranvier. Основной PBS имеет важное значение для удаления meninges. Быстрая очистка имеет решающее значение для жизнеспособности олигодендроки и реализации сильных сторон потока, применяемого с пипеткой.
Олигодендроцит-кондиционированной среды могут быть добавлены в нейронных культур, чтобы получить представление о влиянии олигодендроцитов секретных факторов на нейронной физиологии. Со-культуры олигодендрокти с нейронами также могут быть выполнены для изучения процесса миелинизации.
