在小鼠中进行结肠镜引导捏活检并评估后续组织变化

该方法为研究结肠伤口愈合以及损伤后发生的分子和组织学变化提供了理想的方法。这种方法还可以揭示IBD发病机制。该技术的主要优点是精确控制损伤的位置和伤口愈合过程的时间。

首次执行此方法的个人可能难以将结肠镜插入鼠标的结肠并产生一致的伤口。反复练习这些技术应该能克服这些问题。鉴于此过程涉及多个协调步骤和细微差别，此方法的视觉演示至关重要。

在开始手术之前，将1.9毫米刚性孔内窥镜插入内窥镜护套。并根据制造商的说明将组装的内窥镜连接到光源和视频成像设备上。使用提供的管道将空气泵连接到工作通道旁边的护套左侧的气体阀。

确保工作通道处于打开位置，并通过工作通道插入三个法式活检钳。将钳子推进到护套的末端，而不会突出出护套。接下来，将麻醉鼠标放在其心室侧的内窥镜过渡平台上，通过对踏板反射缺乏反应来确认适当的浸合水平。

涂抹眼药膏后，用室温PBS的附鼠嘴针填充三毫升注射器。将针头插入鼠标肛门约一厘米。轻轻注入 PBS，直到粪便材料被清除。

几个粪便颗粒应与注入的 PBS 一起退出鼠标。将组装的内窥镜插入肛门0.5厘米，将活检钳推进直肠的清除流明，直到钳子的整个下颚超出护套的末端。将钳子转动 90 度，使钳子以东西方向打开，打开钳子，推进钳子约一厘米，以一个平稳、快速的动作关闭和缩回钳子，以收获活检。

要避免在进行活检时完全窒息结肠，请打开气阀的右侧。活检后，立即踩下附着在结肠镜记录装置上的脚踏板，以启动视频录制。并坚定地按下食指对气阀的右侧，以完全覆盖开口，迫使空气进入内窥镜，从而进入结肠。

在封闭位置时，将钳子从护套中缩回直肠流明。将钳子放在伤口上方的直肠壁上，直到下颚底部与视场的顶边缘对齐。继续完全窒息结肠，直到可以清楚地看到伤口。

要获得伤口床的最佳测量，请耐心等待，然后将结肠镜放在一个精确的角度，以便您获得伤口床的最佳图像。在适当的软件程序中打开视频，并将视频推进到显示伤口床可轻松可视化的时间点的帧。封闭的钳子在伤口床上方，靠在直肠壁上，墙是绷紧的。

在每个时间点，获取此帧的快照并编码文件名称，以确保以盲目的方式进行伤口床位的测量。要量化伤口床的大小，请打开 ImageJ 中的图像，并使用自由手选择工具在伤口周围绘制周长。在分析下，选择测量。

该测量值将自动填充在结果窗口中。当获得所有测量结果后，计算随后几天的伤口大小，相对于电子表格中零日大小。在适当的实验终点，打开皮肤和腹部肌肉层，露出实验动物的身体腔，并将封闭的钳子放在结肠下。

轻轻抬起结肠，将其从底层的中点和肛门上切开，从鼠标中收集。使用装有冰冷PBS的20毫升注射器，并配有鼠嘴针，以冲出粪便内的成分。将清除的结肠放在一张滤纸上。

纵向打开结肠，注意中性侧朝下对滤纸。并使用巴斯德移液器覆盖粘膜0.2%甲基蓝色。几秒钟后，排出多余的污渍，在解剖显微镜下查看结肠，找到伤口床。

使用四英寸的微虹膜剪刀在床边切割，小心不要切入肌肉层。并使用细点钳子将解剖的组织转移到管中，用于捕捉冻结和或存储。在适当的实验端点，在一张滤纸上纵向打开收获的结肠，中度侧向下。

轻轻覆盖组织与您选择的固定。在密封容器中用准胶片盖住组织 4 到 6 小时，然后储存在 70% 乙醇中。在处理当天，取出副膜，并在组织中添加0.2%的甲基蓝色，如所示。

排出多余的污渍后，将组织置于解剖显微镜下以定位伤口床。使用带有 10 号刀片的手术刀，直接穿过伤口床的中心，继续直线切割结肠的其余部分，使结肠被切成半长。对于低温切除，嵌入结肠片，使手术刀切开的侧面朝下放在一个半充满组织冷冻介质的底模中。

用细钳将组织固定到位，并将底模固定在金属板上，或将厚铝箔放在干冰上，以硬化冷冻介质。一旦介质底部冻结，在室温下用冷冻介质填充基础模具的剩余体积。将霉菌返回干冰，直到整个组织块冻结。

然后，将模具转移到 80 摄氏度的冰柜中，直到分离。在这里，显示了伤口床的可接受视图的代表性图像，用于准确量化伤口床的大小和伤口的闭合率。在这张伤口床的前视图中，可以观察到伤口床周长的指示器以及切割组织的位置，以便在剖腹产时使伤口床可视化。

在此代表性图像中，可以清楚地观察到伤口床的 H 和 E 染色部分。重要的是要获得伤口床在任何时候点的即时图像，以确保准确评估伤口愈合率。捏活检后，不同的感兴趣的剂可以注射到伤口床，以测试其对伤口愈合率的影响。