Bu yöntem, kolonik yara iyileşmesi ve yaralanma sonrasında meydana gelen moleküler ve histolojik değişiklikleri incelemek için ideal bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem IBD patogenezinde de ışık tutabilir. Bu tekniğin ana avantajı, yaralanmanın yerini ve yara iyileşme sürecinin zamanlamasını hassas bir şekilde kontrol etmektir.
Bu yöntemi ilk kez gerçekleştiren bireyler kolonoskopu farenin kolonuna sokmak ve tutarlı yaralar oluşturmak zorlanabilir. Bu teknikleri tekrar tekrar uygulamak bu sorunların üstesinden gelmelidir. Bu yordamla ilgili birden çok koordineli adım ve nüans göz önüne alındığında, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.
İşleme başlamadan önce, bir endoskop kılıfa 1,9 milimetre sert delikli bir endoskop yerleştirin. Ve monte edilen endoskopu, üreticinin talimatlarına göre ışık kaynağına ve video görüntüleme cihazına takın. Hava pompasını çalışma kanalının yanındaki kılıfın sol tarafındaki gaz vanasına takmak için sağlanan boruyu kullanın.
Çalışma kanalının açık konumda olduğundan emin olun ve çalışma kanalından üç Fransız biyopsi topsunu yerleştirin. Kılıktan çıkıntı yapmadan forsepsleri kılıtın sonuna kadar ilerletin. Daha sonra, uyuşturulmuş fareyi ventral tarafındaki endoskopik bir evreleme platformuna yerleştirin ve pedal refleksine yanıt vermeyerek uygun sedasyon seviyesini onaylayın.
Göz merhemini uyguladıktan sonra, üç mililitrelik bir şırıngayı oda sıcaklığı PBS ile bağlı bir sıçan gavage iğnesi ile doldurun. Ve iğneyi farenin anüsüne yaklaşık bir santimetre yerleştirin. Dışkı malzemesi temizlenene kadar PBS ile hafifçe demleyin.
Aşılanan PBS ile birlikte fareden birkaç dışkı peleti çıkmalıdır. Monte edilen endoskopu anüse 0,5 santimetre yerleştirin ve biyopsi forsepslerini, forsepslerin tam çeneleri kılıtın ucunun ötesine geçene kadar rektumun temizlenmiş lümenine ilerletin. Forsepsleri 90 derece çevirin, böylece çeneler doğu-batı yönünde açılır ve uçları açar ve forsepsleri yaklaşık bir santimetre ilerleterek, biyopsiyi hasat etmek için tek bir pürüzsüz, hızlı hareketle forsepsleri kapatır ve geri çekilir.
Biyopsi yapılırken kolonun tamamen enflamamasını önlemek için gaz vanasının sağ tarafını açık bırakın. Biyopsiden hemen sonra, video kaydını başlatmak için kolonoskop kayıt cihazına bağlı ayak pedalını bastırın. Ve açıklığı tamamen kapatmak için gaz vanasının sağ tarafına bir işaret parmağını sıkıca bastırın, havayı endoskopa ve dolayısıyla kolona zorlar.
Kapalı pozisyondayken, kılıfa geri ve rektal lümene geri çekilin. Ve çenelerin tabanı görüntüleme alanının üst kenarı ile hizalanana kadar, kaleleri yaranın hemen üzerine rektal duvara yerleştirin. Yaranın net bir görünümü gözleninene kadar kolonu tamamen ensufflating devam edin.
Yara yatağının en iyi ölçümlerini elde etmek için sabırlı olun, ardından kolonoskopu hassas bir açıyla yerleştirin, böylece yara yatağının en iyi görüntüsünü elde edersiniz. Videoyu uygun bir yazılım programında açın ve videoyu yara yatağının kolayca görselleştirilebileceği bir noktayı gösteren bir kareye ilerletin. Ve kapalı kümeslerin yara yatağının üstünde ve rektal duvara karşı olduğu ve duvarın gergin olduğu yer.
Her zaman noktasında, bu çerçevenin bir anlık görüntüsünü elde edin ve yara yataklarının ölçümlerinin kör bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için dosya adını kodla. Yara yatağının boyutunu ölçmek için görüntüleri ImageJ'de açın ve yaranın etrafına bir çevre çizmek için Serbest El seçimleri aracını kullanın. Çözümle'nin altında Ölç'ü seçin.
Ve bu ölçümün değeri Sonuçlar penceresinde otomatik olarak doldurulur. Tüm ölçümler elde edildiğinde, sonraki günlerde yaranın boyutunu bir elektronik tablodaki sıfırın üzerindeki boyuta göre hesaplayın. Uygun deneysel uç noktada, deney hayvanının vücut boşluğunu ortaya çıkarmak için cilt ve karın kası katmanlarını açın ve kolonun altına kapalı tokmaklar yerleştirin.
Alttaki mezentery'den serbest bırakmak için kolonu hafifçe kaldırın ve dokuyu fareden toplamak için orta noktasında ve anüste kesin. Dışkı içeriğini temizlemek için buz gibi PBS ile doldurulmuş ve fare gavage iğnesi ile donatılmış 20 mililitrelik bir şırınga kullanın. Ve temizlenmiş kolonu bir filtre kağıdının üzerine yerleştirin.
Kolonu uzunlamasına açın, mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü olmasına dikkat edin. Ve mukozayı %0.2 metilen mavisi ile örtmek için pasteur pipet kullanın. Birkaç saniye sonra, fazla lekeyi boşaltın ve yara yatağını bulmak için kolonu bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin.
Yatağın kenarını kesmek için dört inç Mikro İris Makası kullanın, kas tabakasını kesmemeye dikkat edin. Ve ince noktalı cımbız kullanarak parçalanmış dokuyu çıtçıtlı dondurma ve depolama için bir tüpe aktarın. Uygun deneysel uç noktada, hasat edilen kolonu bir filtre kağıdı parçası üzerinde uzunlamasına açın, mezenterik tarafı aşağı.
Dokuyu seçtiğiniz sabitleyici ile hafifçe örtün. %70 etanolde saklanmadan önce 4 ila 6 saat boyunca kapalı bir kapta dokuyu parafilm ile örtün. İşleme gününde, parafilmi çıkarın ve gösterildiği gibi dokuya% 0.2 metilen mavisi ekleyin.
Fazla lekeyi boşalttıktan sonra, yara yatağını bulmak için dokuyu bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. 10 numaralı bıçaklı bir neşter kullanarak, doğrudan yara yatağının ortasından kesin ve kolonun geri kalanını düz bir çizgide kesmeye devam edin, böylece kolon yarı uzunlamasına kesilir. Kriyoseksiyon için, kolon parçalarını neşter tarafından kesilen tarafın yüzüstü doku dondurma ortamı ile dolu bir taban kalıbına gömün.
Dokuyu ince cımbızla yerine sabitleyin ve donma ortamını sertleştirmek için taban kalıbını kuru buzun üzerine metal bir plakaya veya kalın alüminyum folyoya yerleştirin. Ortamın alt kısmı dondurulduktan sonra, taban kalıbının kalan hacmini oda sıcaklığında donma ortamı ile doldurun. Ve tüm doku bloğu donana kadar kalıbı kuru buza geri verin.
Daha sonra, kalıbı bölümlere kadar 80 santigrat derecelik bir dondurucuya aktarın. Burada, yara yatağının boyutunun ve yaranın kapanma oranının doğru bir şekilde ölçülmesi için yara yatağının kabul edilebilir görünümlerinin temsili görüntüleri gösterilmiştir. Bir yara yatağının bu ex-vivo görünümünde, yara yatağının çevresinin göstergeleri ve kesit üzerine yara yatağının görselleştirilmesini sağlamak için dokunun nerede kesileceği gözlemlenebilir.
Bu temsili görüntüde, bir yara yatağının H ve E leke bölümü açıkça gözlenebilir. Yara iyileşme oranının doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için yara yatağının her zaman anında görüntülerini elde etmek önemlidir. Çimdik biyopsisinin ardından, yara iyileşme oranı üzerindeki etkilerini test etmek için yara yatağına farklı ilgi ajanları enjekte edilebilir.
