Cette méthode fournit une approche idéale pour étudier la cicatrisation des plaies du côlon et les changements moléculaires et histologiques qui se produisent après une blessure. Cette méthode peut également faire la lumière sur la pathogénie des MII. Le principal avantage de cette technique est de contrôler avec précision l’emplacement des blessures et le moment du processus de cicatrisation des plaies.
Les personnes effectuant cette méthode pour la première fois peuvent avoir de la difficulté à insérer le colonoscope dans le côlon de la souris et à créer des blessures constantes. La pratique répétitive de ces techniques devrait surmonter ces problèmes. Compte tenu des multiples étapes coordonnées et nuances impliquées dans cette procédure, la démonstration visuelle de cette méthode est critique.
Avant de commencer la procédure, insérez un endoscope rigide de 1,9 millimètre dans une gaine d’endoscope. Et fixez l’endoscope assemblé à la source lumineuse et au dispositif d’imagerie vidéo selon les instructions du fabricant. Utilisez le tube fourni pour fixer la pompe à air à la vanne de gaz sur le côté gauche de la gaine à côté du chenal de travail.
Assurez-vous que le canal de travail est en position ouverte et insérez trois Français de biopsie à travers le canal de travail. Avancez les forceps jusqu’à l’extrémité de la gaine sans dépasser de la gaine. Ensuite, placez la souris anesthésiée sur une plate-forme de mise en scène endoscopique sur son côté ventral et confirmez le niveau approprié de sedation par manque de réponse au réflexe de pédale.
Après avoir appliqué l’onguent d’oeil, remplissez une seringue de trois millilitres avec une aiguille attachée de gavage de rat avec la température ambiante PBS. Et insérez l’aiguille d’environ un centimètre dans l’anus de la souris. Infuser délicatement de PBS jusqu’à ce que le matériau fécal ait été déblayé.
Plusieurs granulés fécaux devraient sortir de la souris avec le PBS qui a été infusé. Insérez l’endoscope assemblé de 0,5 centimètre dans l’anus et avancez les forceps de biopsie dans le lumen dégagé du rectum jusqu’à ce que les mâchoires complètes des forceps soient au-delà de l’extrémité de la gaine. Tournez les forceps à 90 degrés de sorte que les mâchoires s’ouvrent dans une orientation est-ouest et ouvrent les pointes et avancent les forceps d’environ un centimètre, fermant et rétractant les forceps en un seul mouvement lisse et rapide pour récolter la biopsie.
Pour éviter d’étouffer complètement le côlon pendant la biopsie, laissez le côté droit de la valve à gaz ouvert. Immédiatement après la biopsie, déprimez la pédale fixée au dispositif d’enregistrement du colonoscope pour lancer l’enregistrement vidéo. Et appuyez fermement sur un index contre le côté droit de la valve à gaz pour couvrir complètement l’ouverture, forçant l’air dans l’endoscope et donc dans le côlon.
Retirez les forceps de la gaine et dans le lumen rectal alors qu’ils étaient en position fermée. Et placez les forceps contre la paroi rectale immédiatement au-dessus de la plaie jusqu’à ce que la base des mâchoires soit alignée avec le bord supérieur du champ d’observation. Continuer à insuffler complètement le côlon jusqu’à ce qu’une vue claire de la plaie puisse être observée.
Pour obtenir les meilleures mesures du lit de plaie, soyez patient puis placez le colonoscope à un angle précis afin que vous obteniez votre meilleure image du lit de plaie. Ouvrez la vidéo dans un logiciel approprié et avancez la vidéo sur un cadre montrant un moment où le lit de plaie peut être facilement visualisé. Et à laquelle les forceps fermés sont au-dessus du lit de plaie et contre le mur rectal, et le mur est tendu.
À chaque fois, obtenez un instantané de ce cadre et codez le nom du fichier pour vous assurer que les mesures des lits de plaies sont effectuées de manière aveugle. Pour quantifier la taille du lit de plaie, ouvrez les images d’ImageJ et utilisez l’outil de sélection des mains libres pour tracer un périmètre autour de la plaie. Sous Analyser, sélectionnez Mesure.
Et la valeur de cette mesure se remplira automatiquement dans la fenêtre Résultats. Lorsque toutes les mesures ont été acquises, calculer la taille de la plaie les jours suivants par rapport à la taille du jour zéro dans une feuille de calcul. Au point de terminaison expérimental approprié, ouvrez la peau et les couches abdominales de muscle pour exposer la cavité corporelle de l’animal expérimental et placer les forceps fermés sous le côlon.
Soulevez doucement le côlon pour le libérer de la mesenterie sous-jacente et coupez le tissu à son point médian et à l’anus pour le recueillir de la souris. Utilisez une seringue de 20 millilitres remplie de PBS glacée et équipée d’une aiguille de gavage de rat pour éliminer le contenu fécal. Et placez le côlon défriché sur un morceau de papier filtre.
Ouvrez le côlon longitudilement, en prenant soin que le côté mésentérique est face contre le papier filtre. Et utilisez une pipette Pasteur pour couvrir la muqueuse avec 0,2% de bleu méthylène. Après quelques secondes, égoutter l’excès de taches et voir le côlon sous un microscope disséquant pour localiser le lit de la plaie.
Utilisez des ciseaux Micro Iris de quatre pouces pour couper autour du bord du lit, en prenant soin de ne pas couper dans la couche musculaire. Et utilisez de fines pinces à point pour transférer le tissu disséqué dans un tube pour obtenir une congélation et un stockage instantanés. Au point de terminaison expérimental approprié, ouvrez le côlon récolté longitudilement sur un morceau de papier filtre, côté mésentérique vers le bas.
Couvrez doucement le tissu avec votre fixatif de choix. Couvrir le tissu avec du parafilm dans un contenant scellé pendant 4 à 6 heures avant l’entreposage dans 70 % d’éthanol. Le jour du traitement, retirer le parafilm et ajouter 0,2% de bleu méthylène au tissu, comme démontré.
Après avoir drainé l’excès de tache, placez le tissu sous un microscope disséquant pour localiser le lit de la plaie. À l’aide d’un scalpel avec une lame numéro 10, couper directement à travers le centre du lit de la plaie et continuer à couper à travers le reste du côlon en ligne droite, de sorte que le côlon est coupé en deux dans le sens de la longueur. Pour la cryosection, intégrer les morceaux du côlon de telle sorte que le côté qui a été coupé par le scalpel est face vers le bas dans un moule de base à moitié rempli de tissu congélation milieu.
Fixez le tissu en place avec une pince fine et placez le moule de base sur une plaque métallique ou une feuille d’aluminium épaisse sur le dessus de la glace sèche pour durcir le milieu de congélation. Une fois que la partie inférieure du milieu est congelée, remplissez le volume restant du moule de base avec le milieu de congélation à température ambiante. Et remettre le moule dans la glace sèche jusqu’à ce que tout le bloc tissulaire soit gelé.
Ensuite, transférez le moule dans un congélateur de 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit sectionnant. Ici, des images représentatives des vues acceptables du lit de blessure pour une quantification précise de la taille du lit de blessure et du taux de fermeture de la blessure sont montrées. Dans cette vue ex vivo d’un lit de plaie, on peut observer des indicateurs du périmètre du lit de plaie et de l’endroit où couper le tissu pour permettre la visualisation du lit de la plaie lors de la section.
Dans cette image représentative, une section de tache H et E d’un lit de plaie peut être clairement observée. Il est important d’acquérir des images instantanées du lit de plaie à tout moment afin d’assurer une évaluation précise du taux de cicatrisation des plaies. Après la biopsie de pincement, différents agents d’intérêt peuvent être injectés dans le lit de la plaie pour tester leurs effets sur le taux de cicatrisation des plaies.
