实时研究全血-内皮相互作用和血栓动力学的体外微流体疾病模型

这种体外疾病模型，可用于研究全血和患者衍生细胞的相互作用，特别是内皮，以评估血栓原性和反凝剂的有效性。这是内皮细胞可用于各种情况，可以通过引入定制的微流体或通过调整血流参数进行修改。此外，该模型可用于研究炎症条件下的血栓动力学，或评估抗凝剂和抗血小板治疗的效果。

最终，这些方法可用于个性化医学方法。获得手术性人类肺动脉组织样本后，涂上高亲和力细胞结合60毫升细胞培养盘，每毫升纤维素2毫升5微克，在37摄氏度下孵育该盘至少15分钟。在孵育结束时，在无菌条件下在层流柜中使用无菌钳子，将组织转移到PBS的培养皿中。

如果组织仍在环中，用剪刀切开动脉，注意不要接触容器的最内层，因为内皮很容易损坏和切除。取出纤维素后，在培养皿中加入四毫升完整的内皮细胞介质，并使用钳子将组织样本转移到培养基中，使用手术刀小心地将血管内层刮入培养基中，注意避免在血管壁上观察到的任何脂质积聚。细胞收获后，将盘子放入细胞培养箱。

如果成纤维细胞污染培养，使用磁性亲和细胞分离为CD144，根据制造商的指示，以净化细胞。通常，当流式细胞仪检测到 10% 或更少的污染细胞时，培养被定义为纯细胞。当获得足够数量的内皮细胞供实验使用时，可以针对内皮细胞特异性标记的存在以及缺乏平滑肌肉和上皮细胞标记的原发内皮细胞进行特征描述。

对于流室制备，使用 30 微升 0.1% 明胶对六井流滑梯的一个通道进行编码，并在 37 摄氏度下孵育该滑轨至少 15 分钟。除了商业流室外，定制具有特定尺寸的流室还可用于研究血管几何体对血块动力学的影响。当幻灯片孵育时，用EDTA和三角素和沉淀物从汇合肺动脉内皮细胞培养中收集细胞，通过离心，将细胞重新悬浮在600微升的完整内皮细胞培养基中，并有力但轻轻地将100微升细胞添加到每个通道中，在通道中再添加50微升的完整内皮细胞培养基，为在37摄氏度和5%的二氧化碳下过夜孵育提供足够的媒介，第二天更换该介质以洗去未绑定的细胞。

在培养六天后，细胞应该已经形成了一个稳定的汇合单层。在肺动脉内皮细胞培养的第7天，从未接受抗凝治疗的受试者获得静脉血样，进入109个柠檬酸钠抗凝液管，将血液转移到50毫升管中。血液可以含有病毒和其他传染性物质。

因此，必须始终戴上手套，并遵循使用人体材料的安全指南。荧光标记的血细胞与1至10，000浓度的钙蛋白阿姆红和50微克每毫升，并添加Alexa488纤维蛋白原，然后在37摄氏度下孵育血液15分钟，以允许完全吸收。灌注前30分钟，在内皮细胞培养基中用100微升的一微摩尔组胺和1%的胎儿牛血清治疗肺动脉内皮细胞，无需任何其他添加剂。

并使用装满洗涤缓冲液的 20 毫升注射器冲洗流量系统管，用两毫升洗涤缓冲液加载三至 20 毫升注射器，然后将注射器加载到注射器泵上。使用第二个 20 毫升注射器用嬉皮士加含有 1% 牛血清白蛋白的缓冲液填充流管，并使用肘形 Laura 连接器小心地将管连接到微幻灯片，将幻灯片的插座连接到注射器，通过将包含幻灯片的细胞放置到舞台上并组装实验设置，从显微镜进行修复，调整显微镜并设置成像参数。重量血的重新计算。

这是一个快乐的共同赞助凝固，进一步尽量避免形成气泡，因为这将损坏内皮细胞层，并影响您的结果。灌注前，用重新计算缓冲液稀释血液两次，将微滑入管中的进气管放入血管，按压开始注射器泵。一旦血液开始流过内皮，按开始显微镜使用预先选择的有源通道和感兴趣位置区域获取图像，每 15 秒一次，5 分钟。

在分析结束时，停止记录和注射器泵并正确清理。用钙蛋白 AM Red 标记血小板和 Alexa 488 结合纤维蛋白原，允许通过血小板附着力、纤维和沉积来调查血栓的形成。在非刺激条件下，血小板或纤维蛋白与内皮不结合。

用组胺刺激导致血小板附着力的立即增加，2.5分钟后到达高原，此时点，血小板开始分泌自理因子，诱导血小板聚集和纤维蛋白原裂解到纤维蛋白，导致纤维和沉积在三分钟后形成纤维和沉积，并在4分钟后与血小板形成稳定的聚集。与未经治疗的血液相比，使用直接抗凝剂进行治疗，可抑制血块形成和血小板粘附。灌注五分钟后肺动脉内皮细胞小板相互作用的免疫荧光分析揭示了内皮细胞、细胞接触的维持，如血管内皮卡德林染色所证实的，表明血块形成于内皮模型层，而不是在内皮间隙之间的底层矩阵上。

与肺动脉内皮相比，人类脐静脉内皮细胞的血小板粘附力和纤维素沉积较少。值得注意的是，与健康细胞相比，慢性血栓性肺高血压患者患有原发性肺动脉内皮细胞，血小板粘附性增加，纤维素沉积增加。内皮血栓的生成取决于多种因素，如血管床的起源或生物背景的部分。

使用此方案，血管和血液成分的内在功能障碍，以及抗凝血治疗的有效性可以在血栓形成血栓形成的不同阶段进行测试。该协议可用于了解血液和西奥相互作用，在各种血栓栓塞疾病具有预测患者特异性抗凝治疗反应的最终潜力。