이 체외 질환 모델은 혈전성 및 항응고제의 효과를 평가하기 위해 전혈 및 환자 유래 세포의 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이는 내피 세포가 다양한 상황에서 사용될 수 있으며, 맞춤형 미세유체를 도입하거나 혈류 파라미터를 조정하여 수정할 수 있다. 또한,이 모델은 염증 조건에서 혈전 역학을 연구하거나 항응고제 및 항혈소판 치료의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
궁극적으로, 이러한 접근 법은 개인화 된 의학의 방법으로 사용할 수 있습니다. 외과 인간 폐 동맥 조직 샘플을 얻은 후, 밀리리터 피보로넨틴 당 5 마이크로그램의 2 밀리리터와 결합 하는 60 밀리 리터 세포 배양 접시를 코팅 하 고 적어도 15 분 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양. 인큐베이션의 끝에서, 멸균 조건하에서 라미나르 흐름 캐비닛에 멸균 포셉을 사용하여 조직을 PBS의 페트리 접시로 옮겨 넣습니다.
조직이 여전히 고리에 있는 경우 내피가 쉽게 손상되고 제거되기 때문에 혈관의 가장 안쪽 층을 만지지 않도록주의하면서 가위로 동맥을 잘라냅니다. fibronectin을 제거 한 후, 접시에 완전한 내피 세포 배지의 4 밀리리터를 추가하고 매체로 조직 샘플을 전송하는 집게를 사용하여 메스를 사용하여 혈관의 내부 층을 배지로 조심스럽게 긁어 내고 용기 벽에서 관찰되는 지질 축적을 피하기 위해주의를 기울입니다. 세포가 수확된 후에는 접시를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.
섬유아세포가 배양을 오염시면 제조업체의 지시에 따라 CD144에 자기 친화성 세포 분리를 사용하여 세포를 정화합니다. 일반적으로 배양은 순수하게 정의되며, 유동 세포측정이 10% 이하의 오염 세포를 감지할 때. 내피 세포의 충분한 수가 실험용으로 수득되었을 때, 1차 내피 세포는 내피 세포 특이적 마커의 존재와 부드러운 근육 및 상피 세포 마커의 부재를 특징으로 할 수 있다.
유량 챔버 준비를 위해, 0.1%젤라틴30 마이크로리터로 6개의 웰 플로우 슬라이드의 1개의 채널을 코딩하고 이 슬라이드를 섭씨 37도에서 최소 15분 동안 배양합니다. 상용 유량 챔버 외에도 특정 치수를 가진 맞춤형 유동 챔버를 사용하여 혈전 역학에 대한 혈관 형상의 영향을 연구할 수 있습니다. 슬라이드가 인큐베이팅되는 동안, EDTA와 트립신 및 퇴적물을 가진 컨물류 내피 세포 배양으로부터 세포를 수집하고, 전체 내피 세포 배지의 600 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 100 마이크로리터의 세포를 각 채널에 추가, 추가로 50 마이크로리터를 추가, 전체 세포 채널의 마이크로 리터를 추가, 내측 세포의 추가 50 마이크로 리터를 추가, 내측 세포의 마이크로 리터 를 추가, 전체 세포 의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포 의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터를 추가, 전체 세포의 마이크로 리터의 추가 500 마이크로 리터 , 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 하룻밤 잠복에 충분한 매체를 제공하기 위해 다음 날 배지를 변경하여 언바운드 세포를 씻어내도록 한다.
배양 6일 후, 세포는 안정적인 컨실릭 단층층을 형성했어야 한다. 폐 동맥 내피 세포 배양의 7 일째에, 109 개의 단일 나트륨 구질항제 항응고제 튜브로 항응고 치료를받지 않는 피험자로부터 정맥 혈액 샘플을 획득하고 혈액을 50 밀리리터 튜브로 옮긴다. 혈액은 바이러스 및 그밖 전염하는 에이전트를 포함할 수 있습니다.
따라서 항상 장갑을 착용하고 인간의 재료로 작업하기위한 안전 지침을 따르는 것이 중요합니다. 형광으로 1 에서 10, 000 농도의 칼신 AM 레드와 밀리리터 당 50 마이크로 그램의 혈액 세포를 표시하고 알렉사 488 fibrinogen을 추가 한 다음 완전한 흡수를 허용하기 위해 섭씨 37도에서 혈액을 배양합니다. 관류 30분 전에 내피 세포 배지에 1개의 마이크로몰라 히스타민의 100마이크로리터와 다른 첨가제 없이 1%의 태아 소 혈청을 가진 폐 동맥 내피 세포를 치료하십시오.
그리고 워시 버퍼로 채워진 20 밀리리터 주사기를 사용하여 유동 시스템 튜브를 헹굴하고, 세 번째에서 20 밀리리터 주사기를 세척 버퍼 2밀리리터로 적재하고 주사기를 주사기 펌프에 적재합니다. 두 번째 20 밀리리터 주사기를 사용하여 히피와 1%소세럼 알부민을 함유한 버퍼와 1%의 소굴 알부민을 포함하는 버퍼를 채우고 팔꿈치 모양의 로라 커넥터를 사용하여 튜브를 마이크로 슬라이드에 조심스럽게 연결하고 슬라이드의 출구를 주사기에 연결하고, 슬라이드의 출구를 주사기에 연결하고, 슬라이드를 무대에 배치하여 현미경 검사용에서 수리하여 실험을 위한 세트를 조립합니다. , 현미경을 조정하고 이미징을위한 매개 변수를 설정합니다. 단호한 피의 회화.
그리고 이것은 응고의 행복한 공동 후원자이며, 내피 세포 층을 손상시키고 결과에 영향을 미치기 때문에 기포 형성을 피하십시오. 관류 직전에, 회화 완충으로 혈액을 두 번 희석하고 마이크로 슬라이드의 입구 튜브를 혈액 튜브에 넣고 주사기 펌프에서 시작합니다. 혈액이 내피 위로 흐르기 시작하자마자 현미경을 눌러 미리 선택된 활성 채널 및 관심 위치 영역을 사용하여 이미지를 수집하여 5 분 동안 15 초마다 이미지를 얻습니다.
분석이 끝나면 레코딩과 주사기 펌프를 중지하고 제대로 청소하십시오. 칼신 AM 레드와 알렉사 488 접합 피브리노겐의 첨가와 소소판을 라벨링, 혈소판 부착 및 섬유 및 증착에 의해 혈전 형성의 조사를 허용. 비 자극 조건에서, 내피류에 혈소판 또는 피브린의 결합이 없습니다.
히스타민을 가진 자극은 혈소판 유착의 즉각적인 증가를 초래하며, 이는 2.5 분 후에 고원에 도달하며,이 시점에서 혈소판 응집 및 피브리노겐 분열을 유도하는 자가 크린 인자를 분비하기 시작하여 3 분 후에 섬유 및 증착을 초래하고 4 분 후에 혈소판으로 안정적인 골재의 형성을 초래합니다. 직접 항응고제로 치료하는 것은 치료되지 않은 혈액에 비해 응고 형성과 혈소판 접착력을 모두 억제합니다. 폐 동맥 내피 세포 혈소판 상호 작용의 면역 형광 분석은 5 분 후 내피 세포 혈소판 상호 작용을 밝혀, 내피 세포의 유지 보수를 밝혀, 세포 접촉, 혈관 내피 카헤린 염색에 의해 확인, 내피 모델 층에 혈전 형태보다는 내피 성 모형 층에 형성되는 것을 나타내는 오히려 내피 갭 틈새 사이의 기본 매트릭스에.
인간 탯줄 정맥 내피 세포는 폐 동맥 내피에 비해 혈소판 부착 및 피브린 증착을 적게 보여줍니다. 특히, 만성 혈전색전성 폐 고혈압 환자로부터 병에 걸린 1차 폐 동맥 내피 세포는 건강한 세포에 비해 혈소판 부착및 더 많은 피브린 증착을 나타낸다. 내피의 혈전성혈관은 혈관 침대의 기원 또는 생물학적 배경의 부분과 같은 여러 요인에 의존한다.
이 프로토콜을 사용하여 혈관 및 혈액 성분의 본질적인 기능 장애뿐만 아니라 항 응고 요법의 효과는 혈전증 혈전증 혈전증 의 다른 단계에서 테스트 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 혈액 과 테오 상호 작용을 이해하는 데 사용할 수 있습니다, 항 응고 치료에 환자 특정 반응을 예측하는 궁극적 인 잠재력을 가진 다양한 혈전색전성 질환.
