Dieses In-Vitro-Krankheitsmodell kann verwendet werden, um die Wechselwirkung von Vollblut und Patienten-abgeleiteten Zellen, insbesondere dem Endothel, zu untersuchen, um die Thrombogenität und die Wirksamkeit von Gerinnungsmitteln zu bewerten. Dies ist Endothelzellen kann unter verschiedenen Umständen verwendet werden und kann durch die Einführung von maßgeschneiderten Mikrofluidik oder durch die Anpassung der Blutflussparameter modifiziert werden. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um Thrombus-Dynamik bei entzündlichen Bedingungen zu untersuchen, oder um die Auswirkungen der Antikoagulans und Thrombozytentherapie zu bewerten.
Letztlich können diese Ansätze in einer Methode der personalisierten Medizin verwendet werden. Nach Erhalt einer chirurgischen menschlichen Lungenarteriengewebeprobe, mantel Hochaffinität Zellbindung 60 Milliliter Zellkulturschale mit zwei Millilitern von fünf Mikroliter pro Milliliter Fiboronectin und inkubieren die Schale bei 37 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten. Verwenden Sie am Ende der Inkubation sterile Zangen in einem laminaren Strömungsschrank unter sterilen Bedingungen, um das Gewebe in eine Petrischale von PBS zu übertragen.
Wenn sich das Gewebe noch in einem Ring befindet, schneiden Sie die Arterie mit einer Schere auf, wobei Sie darauf achten, die innerste Schicht des Gefäßes nicht zu berühren, da das Endothel leicht beschädigt und entfernt wird. Nach dem Entfernen des Fibronectin, fügen Sie vier Milliliter komplette endotheliale Zellmedium in die Schale und verwenden Zangen, um die Gewebeprobe in das Medium zu übertragen, verwenden Sie ein Skalpell, um sorgfältig die innere Schicht des Gefäßes in das Medium zu kratzen, wobei darauf zu achten ist, dass Lipidansammlungen, die in der Gefäßwand beobachtet werden, vermieden werden. Nachdem die Zellen geerntet wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator.
Wenn Fibroblasten die Kultur kontaminieren, verwenden Sie magnetische Affinitätszelltrennung für eine CD144, gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Zellen zu reinigen. Im Allgemeinen wird Kultur als rein definiert, wenn die Durchflusszytometrie 10 % oder weniger kontaminierende Zellen erkennt. Wenn die ausreichende Anzahl von Endothelzellen für den experimentellen Einsatz erhalten wurde, können die primären Endothelzellen für das Vorhandensein von endotheliale zellspezifischen Markern und für das Fehlen glatter Muskel- und Epithelzellmarker charakterisiert werden.
Für die Strömungskammervorbereitung einen Kanal eines sechs Well-Flow-Schlittens mit 30 Mikrolitern 0,1% Gelatine kodieren und diese Folie mindestens 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Neben handelsüblichen Strömungskammern können kundenspezifische Strömungskammern mit spezifischen Abmessungen verwendet werden, um den Einfluss der Gefäßgeometrie auf die Gerinnseldynamik zu untersuchen. Während die Folie inkubiert, sammeln Sie die Zellen aus einer konfluenten pulmonalen Arterie Endothelzellkultur mit EDTA und Trypsin und Sediment, dass Zellen durch Zentrifugation, re suspendieren das Pellet in 600 Mikroliter von kompletten endothelialen Zellmedium und kräftig, aber sanft, fügen Sie 100 Mikroliter Zellen in jedem Kanal, fügen Sie weitere 50 Mikroliter der kompletten endothelialen , um ausreichend Medium für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zur Verfügung zu stellen, das Medium am nächsten Tag zu ändern, um die ungebundenen Zellen wegzuwaschen.
Nach sechs Tagen kulturbilden die Zellen eine stabile konfluente Monoschicht. Erwerben Sie am siebten Tag der Lungenarterien-Endothelzellkultur eine venöse Blutprobe von Probanden, die keine Antikoagulationsbehandlung in 109 Mononatriumcitrat-Gerinnungsmittelröhren erhalten, und übertragen Sie das Blut in eine 50-Milliliter-Röhre. Blut kann Viren und andere Infektionserreger enthalten.
Daher ist es wichtig, immer Handschuhe zu tragen und die Sicherheitshinweise für die Arbeit mit menschlichem Material zu befolgen. Fluoreszierend beschriftet die Blutzellen mit 1 bis 10 000 Konzentration von Calcein AM Red und 50 Mikrogramm pro Milliliter und fügen Sie Alexa 488 Fibrinogen, dann inkubieren das Blut bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um eine vollständige Absorption zu ermöglichen. 30 Minuten vor der Perfusion die lungenarterienalen Endothelzellen mit 100 Mikrolitern eines Mikromolar-Histamins in Endothelzellmedium und 1%fetalem Rinderserum ohne weitere Zusatzstoffe behandeln.
Und verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze gefüllt mit Waschpuffer, um die Durchflusssystemrohre zu spülen, eine Dritte- bis 20-Milliliter-Spritze mit zwei Milliliter Waschpuffer zu laden und die Spritze auf eine Spritzenpumpe zu laden. Verwenden Sie eine zweite 20-Milliliter-Spritze, um die Durchflussrohre mit Hippies plus Puffer mit 1% Rinderserumalbumin zu füllen und verwenden Sie einen Ellenbogenform Laura-Stecker, um die Rohre sorgfältig mit dem Mikroschlitten zu verbinden, den Ausgang des Dias mit der Spritze zu verbinden, die Reparatur aus der Mikroskopie, indem Sie die Zelle mit Dia auf die Bühne legen und das Setup für das Experiment zusammenstellen , stellen Sie das Mikroskop ein und stellen Sie die Parameter für die Bildgebung ein. Verkalkung von emphatischem Blut.
Und dies ist ein glücklicher Co-Sponsor der Gerinnung, darüber hinaus versuchen, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, weil dies die Endothelzellschicht beschädigt und Ihre Ergebnisse beeinflussen wird. Unmittelbar vor der Perfusion das Blut zweimal mit dem Entkalkungspuffer verdünnen und das Einlassrohr des Mikroschlittens in die Blutröhre legen, auf die Spritzenpumpe drücken. Sobald das Blut über das Endothel fließt, drücken Sie den Druck auf das Mikroskop, um Bilder mit den vorgewählten aktiven Kanälen und Interessensbereichen alle 15 Sekunden für fünf Minuten zu erfassen.
Beenden Sie am Ende der Analyse die Aufzeichnung und die Spritzenpumpe und reinigen Sie sie ordnungsgemäß. Die Kennzeichnung von Thrombozyten mit Calcein AM Red und die Zugabe von Alexa 488 konjugiertem Fibrinogen ermöglicht die Untersuchung der Thrombusbildung durch Thrombozytenhaftung und Faser- und Ablagerung. Unter nicht stimulierten Bedingungen gibt es keine Bindung von Thrombozyten oder Fibrin an das Endothel.
Die Stimulation mit Histamin führt zu einer sofortigen Erhöhung der Thrombozytenhaftung, die nach 2,5 Minuten ein Plateau erreicht, zu diesem Zeitpunkt beginnen die Thrombozyten autokrine Faktoren zu sezernieren, die eine Thrombozytenaggregation und Fibrinogenspaltung zu Fibrin induzieren, was zu Ballaststoffen und Ablagerungen nach drei Minuten und der Bildung eines stabilen Aggregats mit den Thrombozyten nach vier Minuten führt. Die Behandlung mit einem direkten Gerinnungsmittel hemmt sowohl die Gerinnselbildung als auch die Thrombozytenhaftung im Vergleich zu unbehandeltem Blut. Immunfluoreszenzanalyse der pulmonalen Arterien-Endothelzellplättchen-Wechselwirkungen nach fünf Minuten Perfusion, zeigt die Aufrechterhaltung der Endothelzelle, Zellkontakte, wie durch vaskuläre endotheliale Cadherinfärbung bestätigt, was darauf hindeutet, dass sich die Blutgerinnsel auf endothelialen Modellschichten und nicht auf der zugrunde liegenden Matrix zwischen endothelialen Lücken bilden.
Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen zeigen weniger Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung im Vergleich zu Pulmonalen-Endothel. Insbesondere, kranke primäre lungenarterienarteriende Endothelzellen von chronischen thromboembolischen pulmonalen Hypertonie-Patienten, zeigen eine erhöhte Thrombozytenadhäsion und mehr Fibrin-Abscheidung im Vergleich zu gesunden Zellen. Die Thrombogenität des Endothels hängt von mehreren Faktoren wie dem Ursprung des Gefäßbettes oder den Teilen des biologischen Hintergrunds ab.
Mit diesem Protokoll können intrinsische Funktionsstörungen in Gefäß- und Blutbestandteilen sowie die Wirksamkeit der antikoagulierten Therapie in verschiedenen Phasen der Thrombosehämostase getestet werden. Dieses Protokoll kann zum Verständnis von Blut- und Theo-Wechselwirkungen bei verschiedenen thromboembolischen Erkrankungen mit dem ultimativen Potenzial verwendet werden, patientenspezifische Reaktionen auf die Antikoagulationstherapie vorherzusagen.
