分子动态模拟是一种计算技术，可用于探索分子运动，可以揭示对理解生化和细胞功能至关重要的构象变化。探测大分子可访问的动态运动范围是很困难的。将分子动态模拟的结果与实验数据结合使用，可以评估其功能重要性。
我们将使用分子动态模拟演示癌症患者观察到的突变如何影响 EGFR 靶向确认和配体结合。要准备野生型 apo 活动 EGFR 我们的激酶结构，请打开 Kymera 可视化程序，并在文件菜单下单击"按 ID 提取"。选择蛋白质数据库数据库并指定蛋白质数据库 2GS2 代码。要构建缺失的结构 2GS2 元件，请从其他 EGFR 结构获取这些段。
要在 EGFR 中构造五个残留谷氨酸 746 到丙氨酸 750 ELREA 删除，请单击收藏夹、序列和显示序列以打开野生型 2GS2 序列。在生成的序列窗口中，单击编辑并添加序列以选择删除突变的 FASTA 格式序列。在对齐窗口中，选择结构和模型或同源。
在弹出窗口中，指定 2GS2 复合结构作为模板，将突变序列指定为要建模的查询，然后根据 zDOPE 评分和目视检查从生成的模型中选择突变模型。为了准备野生型apo非活性EGFR激酶结构，打开蛋白质数据库结构2GS7，并添加其他EGFR结构中缺失的段，对缺失突变体进行建模，如所证明的。为了准备ATP绑定野生型活性EGFR激酶结构，使用蛋白质数据库结构2ITX作为原理结构，使用其他EGFR结构构建缺失段，并采用建模器对缺失突变体进行建模。
要构建野生型EGFR非对称二角结构，在Kymera中打开2GS2，点击工具、高阶结构和单元单元，将结构转换为包含非对称排列中的活化器和接收方激酶的生物组件。选择 2GS2 结构并输入"复制"，然后从对称操作产生的二元调的多个副本中选择并保存单个非对称二元。要构建丙氨酸 702 瓦林突变体，请选择工具、结构编辑和旋转器，以用瓦林取代丙氨酸 702。
打开 Maestro 中的结构并单击蛋白质制备向导按钮，然后选择添加氢原子并填充缺失的侧链原子，然后单击预处理。要确定pH7.0值电离残留物的质子状态，请单击精炼并使用PROPKA优化芦笋、谷氨酰胺和组胺残留物的方向，以进行氢键结合，然后最小化结构。要设置仿真系统，请打开 LEAP 程序并导入琥珀色 FF14SB 力场和 TIP3P 水分子。
对于 ATP 绑定系统，导入 ATP 的参数并加载结构。用显式 TIP3P 水分子在八面体盒中分解结构，这些分子从蛋白质的表面原子向各个方向延伸 10 个焦虑体。检查皮带系统并添加必要的离子以中和。
为了充分模拟生物分子系统，在模拟框中添加额外的钠和氯化原子，使系统盐浓度达到0.15摩尔，然后生成并保存系统的拓扑和协调文件，作为后续生产模拟的输入。使用琥珀色，最初能量最小化仿真系统，以规避任何不利的配置。在最小化输入文件中，调整总最小化周期的最大周期变量和周期数，以指示最陡峭下降算法的周期数。
使用约束重量变量对约束掩码参数指定的溶质原子施加约束力。在多个步骤中执行最小化，逐渐将对溶质原子施加的约束从每摩尔 25 千卡到 0 千卡，然后使用命令运行最小化。将系统加热 100 皮秒，从 0 到 300 开尔文，并使用命令在溶质原子上设置每平方的 10 千卡摩尔。
然后使用命令执行加热。在等温体等值合奏下平衡系统 900 皮秒，为长距离静电相互作用设置 9 个焦虑距离截止点，逐渐将溶质原子约束降低至每摩尔 0.1 千卡，并完成平衡，使用无拘无束的 5 纳秒模拟。如所示，使用命令运行均衡。
调整文本以允许生产模拟执行 100 纳秒，每 10 秒保存一次构象，然后按照指示命令运行模拟。要在野生类型和突变EGFR激酶模拟中可视化构象样本，请打开视觉分子动力学中的琥珀色拓扑文件和相应的轨迹文件。并使用方便的二级结构表示，从记录的轨迹分析蛋白质的整体结构动力学。
然后查看原子和感兴趣的残留物之间的特定相互作用，例如催化必需的裂解素745-谷氨酸762盐桥。或者，以蛋白质数据库格式保存在模拟过程中采样的多个构象，并在 Kymera 中打开构象。使用匹配器选项将结构叠加在初始或中位结构上，并在实心结构中显示中位结构，其余对齐结构以褪色的白色显示，以便更清晰地可视化记录的结构运动。
为了分析野生型和突变型EGFR的全局稳定性，并检查不同结构单元的灵活性，导入琥珀色类型和相应的轨迹文件。在根均方偏差输入文件中，指示初始结构的主干原子作为根均方拟合的参考。在根均方波动输入文件中，指示初始结构的C-alpha原子作为根均方拟合的参考。
然后使用 CPPTRAJ 程序运行分析并绘制输出数据。或者，要对齐构象组合，并根据 C-alpha 原子根均方偏差对每个残留物进行着色，请打开 Kymera 中的构象，并使其与匹配器选项对齐。按属性选择工具、描述和渲染。
选择构象组合的残差，将 C-alpha 根平均平方偏差设置为属性，然后单击"确定"。构象的链迹将分别为蓝色、白色或红色，分别反映高、中、低结构稳定性的区域。要分析 ATP 与野生类型和删除 EGFR 之间的氢键相互作用，请准备 CPPTRAJ 脚本以执行此任务。仅使用 Nointramol 变量指定分子间氢键的分析，并定义一个与供体接受距离小于或等于 3.5 安格罗姆且键角大于或等于 135 度的氢键。
要评估分子内部的相互作用，例如，催化重要的赖氨酸和谷氨酸残留物之间的相互作用，指定赖氨酸作为氢供体，谷氨酸指定为接受物残留物，并运行指示的脚本，以便分析结果。为了计算ATP与野生型和删除EGFR之间的结合自由能量，在 LEAP 程序中准备气相配体受体和配体受体复合蛋白数据库文件，并设置 ATP 作为配体和 EGFR 作为受体。将通用出生的无线电值设置为 M Bond I2。然后生成琥珀色拓扑并协调气相蛋白质数据库文件的文件。
同样，要计算野生型和丙氨酸702瓦林EGFR的活化剂和受体激酶之间的结合自由能量，请指定接收方激酶为配体，将活化器激酶指定为受体，并保存相应的拓扑和坐标文件。准备一个分子力学概括出生表面积输入文件，将IGGB值设置为2，盐孔设置为0.1。然后使用 mmpbsa 。
py 脚本在 Amber 中可用，请按指示输入命令以执行绑定能量计算并分析输出数据。在这个具有代表性的100纳秒模拟中，与野生型EGFR相比，丙氨酸702瓦林突变体显示出并列性B段的构象稳定性增加，这可能是由于更紧密的疏水相互作用。丙氨酸702瓦林突变体还表现出与野生型EGFR相对活化剂和接收器激酶之间的自由结合能量较低，代表更有利的暗化相互作用，保持活性EGFR激酶构象。
与野生型EGFR相比，删除突变的模拟导致功能键α-螺旋的C-alpha原子波动较低，延长了EGFR活动状态的时间。缺失突变还导致Lysine745和谷氨酸762的侧链极原子之间频繁形成氢键，与野生型EGFR相比，EGFR酶活性的关键相互作用。此外，ATP和EGFR之间的氢键数量大于野生型EGFR的删除突变体。
删除突变还导致 EGFR 非活动状态 Alpha C 螺旋的向内运动，这是向活动状态过渡期间预期的结构变化。相比之下，野生类型非活动EGFR的αC螺旋保持了其初始构象。为了评估突变的影响，必须选择结构的适当构象状态，并适当准备和平衡这些结构。
将分子动态模拟与实验研究相结合非常重要，因为这些技术之间的协同作用有利于结果的解读，并可以指导其他湿实验室实验。
