분자 동적 시뮬레이션은 분자 운동을 탐구하는 데 사용할 수 있으며 생화학 적 및 세포 기능을 이해하는 데 중요한 변형 변화를 나타낼 수있는 계산 기술입니다. 거대 분자에 액세스할 수 있는 동적 모션의 범위를 조사하는 것은 어렵습니다. 실험 데이터와 함께 분자 동적 시뮬레이션의 결과를 사용하면 기능적 중요성을 평가할 수 있습니다.
우리는 암 환자에서 관찰된 돌연변이가 EGFR 표적화 확인 및 리간 드바인딩에 어떻게 영향을 미치는지 분자 동적 시뮬레이션을 사용하여 시연할 것입니다. 야생형 아포 활성 EGFR의 키나아제 구조를 준비하려면 키메라 시각화 프로그램을 열고 파일 메뉴에서 ID.단백질 데이터 뱅크 데이터베이스를 선택하고 단백질 데이터 뱅크 2GS2 코드를 지정합니다. 누락된 구조 2GS2 요소를 빌드하려면 다른 EGFR 구조에서 이러한 세그먼트를 획득합니다.
5개의 잔류글루타메이트(746)를 EGFR에서 알라닌 750 ELREA 삭제하도록 구성하려면, 즐겨찾기, 시퀀스 및 쇼 시퀀스를 클릭하여 야생형 2GS2 시퀀스를 엽니다. 그리고 결과 시퀀스 창에서 편집을 클릭하고 시퀀스를 추가하여 삭제 돌연변이 FASTA 형식 시퀀스를 선택합니다. 정렬 창에서 구조 및 모델 또는 상동성을 선택합니다.
팝업 창에서 2GS2 복합 구조를 모델링할 쿼리로 템플릿 및 돌연변이 시퀀스로 지정한 다음 zDOPE 점수 및 육안 검사를 기반으로 결과 모델에서 돌연변이 모델을 선택합니다. 야생형 아포 비활성 EGFR 키나아제 구조를 준비하기 위해, 단백질 데이터 뱅크 구조 2GS7을 열고 다른 EGFR 구조에서 누락된 세그먼트를 추가하여, 입증된 바와 같이 삭제 돌연변이 형태를 모델링한다. ATP 바인딩 야생형 활성 EGFR 키나아제 구조를 준비하기 위해 단백질 데이터 뱅크 구조 2ITX를 원리 구조로 사용하여 다른 EGFR 구조를 사용하여 누락된 세그먼트를 구축하고 모델러를 사용하여 삭제 돌연변이 형태를 모델링하는 것을 입증하였다.
야생형 EGFR 비대칭 이머 구조를 구성하기 위해, 키메라에서 2GS2를 열고 공구를 클릭하고, 고차 구조 및 단위 셀을 비대칭 배열에서 활성제 및 수신기 키나아제함유 생물학적 어셈블리로 변환한다. 2GS2 구조를 선택하고 복사본을 입력한 다음 대칭 작업으로 인한 디머의 여러 복사본에서 단일 비대칭 디머를 선택하고 저장합니다. 알라닌 702 valine 돌연변이를 구축하려면 도구, 구조 편집 및 로타머를 선택하여 알라닌 702를 바이로 대체합니다.
마에스트로의 구조를 열고 단백질 준비 마법사 버튼을 클릭한 다음 수소 원자를 추가하고 누락된 측면 체인 원자를 채우고 사전 프로세스를 클릭합니다. pH 7.0에서 이온화성 잔류물의 프로토네이션 상태를 결정하기 위해, 정제를 클릭하고 PROPKA를 사용하여 수소 결합을 위한 아스파라진, 글루타민 및 히스타민 잔류물의 방향을 최적화한 다음 구조를 최소화합니다. 시뮬레이션 시스템을 설정하려면 LEAP 프로그램을 열고 앰버 FF14SB 힘 필드와 TIP3P 물 분자를 가져옵니다.
ATP 바인딩 시스템의 경우 ATP에 대한 매개 변수를 가져오고 구조를 로드합니다. 단백질의 표면 원자에서 모든 방향으로 10 개의 앙스트롬을 확장하는 명시적 TIP3P 물 분자를 가진 옥타헤드랄 상자에 구조를 솔바테하십시오. 벨트 시스템을 확인하고 필요한 이온을 추가하여 중화하십시오.
생체 분자 시스템을 충분히 모델링하려면 시뮬레이션 상자에 나트륨 과 염화물 원자를 추가하여 시스템 염분 농도를 0.15 어금니로 가져온 다음 토폴로지 및 조정 파일을 생성 및 저장하여 후속 생산 시뮬레이션에 대한 입력으로 사용하십시오. 호박색을 사용하여 처음에는 에너지가 시뮬레이션 시스템을 최소화하여 불리한 구성을 우회합니다. 최소화 입력 파일에서 총 최소화 주기및 사이클 수에 대한 최대 사이클 변수를 조정하여 가장 가파른 하강 알고리즘의 사이클 수를 나타냅니다.
구속 력 변수를 사용하여 구속 마스크 매개 변수에 지정된 솔루트 원자에 구속력을 적용합니다. 여러 단계로 최소화를 수행하여 솔직 원자에 적용되는 구속을 두더지 앙스트롬 사각형당 25~0킬로칼로리로 낮추고 명령을 사용하여 최소화를 실행합니다. 0에서 300 켈빈까지 100 picoseconds에 대한 시스템을 가열하고 솔직 한 원자에 평방 앙스트롬 구속 당 10 킬로 칼로리 어어를 설정하는 명령을 사용합니다.
그런 다음 명령을 사용하여 가열을 수행합니다. 이소레 동종 앙상블 아래 900 picoseconds에 대한 시스템을 상화하고 장거리 정전기 상호 작용을위한 9 개의 앙스트롬 거리 차단을 설정하고, 점차적으로 두더지 앙스트롬 사각형 당 0.1 킬로칼로리로 솔루트 원자 구속을 낮추고 억제되지 않은 5 나노 초 시뮬레이션으로 평형을 마무리합니다. 표시된 대로 명령으로 균등화를 실행합니다.
텍스트를 조정하여 100나노초 동안 프로덕션 시뮬레이션을 수행할 수 있도록 조정한 다음 10pico초마다 저장되는 준수를 수행한 다음 표시된 대로 명령으로 시뮬레이션을 실행합니다. 야생 유형 및 돌연변이 EGFR 키나아제 시뮬레이션 중에 변형 샘플을 시각화하려면 시각적 분자 역학에서 호박 색 토폴로지 파일과 해당 궤적 파일을 엽니다. 그리고 편리한 이차 구조 표현을 사용하여, 기록된 궤도에서 단백질의 전반적인 구조적 역학을 분석한다.
그런 다음 촉매 필수 리신 745-글루타메이트 762 소금 다리와 같은 원자와 관심잔류 사이의 특정 상호 작용을 봅니다. 또는 단백질 데이터 뱅크 형식으로 시뮬레이션 중에 샘플링된 여러 적합성을 저장하고 Kymera에서 적합성을 엽니다. 중매기 옵션을 사용하여 초기 또는 중앙분리구 구조에 구조를 중첩하고 중앙분리형 구조의 중간 구조를 페이드 화이트의 나머지 구조를 표시하여 기록된 구조 움직임을 보다 명확하게 시각화할 수 있도록 합니다.
야생형 및 돌연변이 EGFR의 글로벌 안정성을 분석하고 다양한 구조 단위의 유연성을 검사하기 위해 호박색 유형학 및 해당 궤적 파일을 가져옵니다. 루트 평균 제곱 편차 입력 파일에서 초기 구조의 백본 원자를 루트 평균 사각형 피팅에 대한 참조로 나타냅니다. 루트 평균 정사각형 변동 입력 파일에서 초기 구조의 C-알파 원자를 루트 평균 사각형 피팅에 대한 참조로 나타냅니다.
그런 다음 CPPTRAJ 프로그램을 사용하여 분석을 실행하고 출력 데이터를 플롯합니다. 또는, 변형 앙상블을 정렬하고 C-알파 원자 루트 평균 사각 편차에 따라 각 잔류물을 색칠, 키메라의 적합성을 열고 중매 옵션에 정렬합니다. 특성별로 도구, 묘사 및 렌더링을 선택합니다.
변형 앙상블의 잔류물을 선택하고 C-알파 루트 평균 사각형 편차를 특성으로 설정한 다음 확인을 클릭합니다. 응표의 체인 추적은 각각 높은, 중간 및 낮은 구조 안정성의 영역을 반영하는 파란색, 흰색 또는 빨간색으로 칠하게 됩니다. ATP와 야생형 및 삭제 EGFR 간의 수소 결합 상호 작용을 분석하려면 CPPTRAJ 스크립트를 준비하여 이 작업을 수행합니다. 분자 간 수소 결합에 대한 분석을 노인트라몰 변수와만 지정하고 3.5 앙스트롬 이하의 기증자 수용자 거리와 135도 보다 크거나 동일한 결합 각도를 가진 수소 결합을 정의한다.
분자 내 상호 작용을 평가하기 위해, 예를 들어, 촉매적으로 중요한 리신과 글루타민산 잔류물 사이의, 리신을 수소 기증자로 지정하고 글루타민트는 수용체 잔류물으로 지정하고 결과의 분석을 허용하도록 지시된 대로 스크립트를 실행한다. ATP와 야생형 및 삭제 EGFRs 간의 결합 없는 에너지를 계산하기 위해, LEAP 프로그램에서 가스상 리간드 수용체 및 리간드 수용체 복합 단백질 데이터 뱅크 파일을 준비하고 ATP를 수용체로서 리간드 및 EGFR로 설정한다. 일반화된 태어난 무선 값을 M 본드 I2로 설정합니다. 그런 다음 가스 상 단백질 데이터 뱅크 파일에 대한 호박토폴로지 및 좌표 파일을 생성합니다.
유사하게, 야생형 및 알라닌 702 볼린 EGFRs의 활성제 및 수신기 키나아제 사이의 결합 없는 에너지를 계산하기 위해, 수신기 키나아제를 수용체로서 리간드 및 활성제 키나아제로 지정하고 해당 토폴로지 및 좌표 파일을 저장한다. 태어난 표면적 입력 파일을 일반화한 분자 역학을 준비하고 IGB 값을 2로 설정하고 소금콘을 0.1로 설정합니다. 그런 다음 mmpbsa를 사용하.
황색에서 사용할 수있는 py 스크립트는 바인딩 에너지 계산을 실행하고 출력 데이터를 분석하기 위해 지시 된 대로 명령을 입력합니다. 이러한 대표적인 100 나노초 시뮬레이션 동안, 알라닌 702 볼린 돌연변이는 야생형 EGFR에 비해 더 엄격한 소수성 상호작용으로 인해 병자멤브레인 B 세그먼트의 형성 안정성이 증가하는 것으로 나타났다. 알라닌 702 valine 돌연변이는 또한 활성 EGFR 키나아제 형성을 유지하는 더 유리한 디머 상호 작용을 나타내는 야생 형 EGFR에 비해 활성제와 수신기 키나아제 사이의 결합의 낮은 자유 에너지를 나타냈다.
삭제 돌연변이의 시뮬레이션은 야생 형 EGFR에 비해 기능적으로 키 알파 C-나선의 낮은 C-알파 원자 변동을 초래하고, EGFR 활성 상태의 시간을 연장. 삭제 돌연변이는 또한 야생 형 EGFR에 비해 EGFR 효소 활성에 대한 주요 상호 작용인 리신 745및 글루타메이트 762의 측면 사슬 극성 원자 사이의 수소 결합의 빈번한 형성을 초래했다. 또한, ATP와 EGFR 사이의 수소 결합의 수는 야생 형 EGFR에 대한 것보다 삭제 돌연변이에 대한 더 컸다.
삭제 돌연변이는 또한 EGFR 비활성 상태 알파 C-나선의 내적 움직임을 초래, 활성 상태로 전환 하는 동안 예상 되는 구조적 변화. 대조적으로, 야생 형 비활성 EGFR의 알파 C-나선은 초기 형성을 유지했다. 돌연변이의 충격을 평가하기 위하여는, 구조물의 적당한 형성 상태를 선택하고 제대로 준비하고 이 구조물을 평형하는 것이 중요합니다.
이러한 기술 간의 시너지 효과는 결과의 해석에 도움이 되고 추가 습식 실험실 실험을 알릴 수 있으므로 분자 동적 시뮬레이션과 실험 연구를 결합하는 것이 중요합니다.
