La simulazione dinamica molecolare è una tecnica computazionale che può essere utilizzata per esplorare i moti molecolari e può rivelare cambiamenti conformazionali cruciali per comprendere la funzione biochimica e cellulare. Sondare l'intervallo di movimenti dinamici accessibili a una macromolecola è difficile. L'utilizzo dei risultati delle simulazioni dinamiche molecolari in combinazione con i dati sperimentali consente di valutare il loro significato funzionale.
Dimostreremo utilizzando simulazioni dinamiche molecolari come le mutazioni osservate nei pazienti oncologici influenzano le conferme di targeting EGFR e il legame del ligando. Per preparare l'EGFR attivo apo di tipo selvaggio, la nostra struttura chinasi, aprire il programma di visualizzazione Kymera e, nel menu del file, fare clic su recupera per ID.Selezionare il database protein Data Bank e specificare il codice Protein Data Bank 2GS2. Per costruire gli elementi strutturali mancanti 2GS2, acquisire questi segmenti da altre strutture EGFR.
Per costruire la cancellazione da 746 ad alanina 750 ELREA dei cinque residui in EGFR, fate clic su preferito, sequenza e mostra sequenza per aprire la sequenza 2GS2 di tipo selvaggio. E nella finestra di sequenza risultante, fate clic su modifica (Edit) e aggiungete la sequenza per selezionare la sequenza di formato FASTA mutante di eliminazione. Nella finestra di allineamento, selezionate la struttura e il modello o l'omologia.
Nella finestra popup, specificate la struttura composita 2GS2 come modello e la sequenza mutante come query da modellare, quindi selezionate un modello mutante dai modelli risultanti in base al punteggio zDOPE e all'ispezione visiva. Per preparare la struttura apo inattiva di tipo selvaggio EGFR chinasi, aprire la struttura protein data bank 2GS7 e aggiungere i segmenti mancanti dalle altre strutture EGFR, modellando la forma mutante di cancellazione come dimostrato. Per preparare la struttura attiva della chinasi EGFR associata a ATP, utilizzare la struttura 2ITX della Protein Data Bank come struttura principale, costruendo i segmenti mancanti utilizzando altre strutture EGFR e modellando la forma mutante di eliminazione utilizzando il modellatore come dimostrato.
Per costruire la struttura asimmetrica del dimero EGFR di tipo selvatico, aprire 2GS2 in Kymera e fare clic su strumenti, struttura di ordine superiore e cella unitaria per convertire la struttura nell'assieme biologico che contiene l'attivatore e le chinasi del ricevitore nella disposizione asimmetrica. Selezionate la struttura 2GS2 e immettete fate copie, quindi selezionate e salvate un singolo dimero asimmetrico dalle copie multiple del dimero risultanti dalle operazioni di simmetria. Per costruire il mutante 702 valine alanina, selezionare strumenti, modifica della struttura e rotameri per sostituire l'alanina 702 con la soluzione.
Aprire le strutture in Maestro e fare clic sul pulsante della preparazione guidata proteine, quindi selezionare aggiungi atomi di idrogeno e riempi gli atomi mancanti della catena laterale e fai clic su pre-processo. Per determinare gli stati di protonazione dei residui ionizzabili a pH 7.0, fare clic su refine e utilizzare PROPKA per ottimizzare l'orientamento dei residui di asparagina, glutammina e istamina per l'incollaggio dell'idrogeno, quindi ridurre al minimo la struttura. Per impostare il sistema di simulazione, aprire il programma LEAP e importare il campo di forza Amber FF14SB e le molecole d'acqua TIP3P.
Per i sistemi associati a ATP, importare i parametri per ATP e caricare la struttura. Solvate la struttura in una scatola ottaedrale con molecole d'acqua TIP3P esplicite che estendono 10 angstrom in tutte le direzioni dagli atomi superficiali della proteina. Controllare il sistema di nastri e aggiungere gli ioni necessari per neutralizzarlo.
Per modellare a sufficienza i sistemi biomolecolari, aggiungere ulteriori atomi di sodio e cloruro alla scatola di simulazione per portare la concentrazione di sale del sistema a 0,15 molare, quindi generare e salvare la topologia e i file di coordinate del sistema per fungere da input per la successiva simulazione di produzione. Utilizzando Amber, inizialmente l'energia riduce al minimo il sistema di simulazione per aggirare eventuali configurazioni sfavorevoli. Nel file di input di minimizzazione, regolare la variabile di ciclo massimo per il ciclo di minimizzazione totale e il numero di cicli per indicare il numero di cicli per l'algoritmo di discesa più ripido.
Utilizzate la variabile di peso del sistema di ritenuta per applicare la forza di ritenuta sugli atomi di soluto specificati dal parametro della maschera di ritenuta. Effettuare la minimizzazione in più passaggi, abbassando gradualmente il sistema di ritenuta applicato sugli atomi di soluto da 25 a 0 chilocalorie per mole angstrom quadrato, quindi utilizzare il comando per eseguire la minimizzazione. Riscaldare il sistema per 100 picosecondi da 0 a 300 Kelvin e utilizzare i comandi per impostare un molare da 10 chilocalorie per sistema di angstrom quadrato sugli atomi di soluto.
Quindi utilizzare il comando per eseguire il riscaldamento. Equilibrare il sistema per 900 picosecondi sotto un insieme isotermico isobarico e impostare un taglio della distanza di nove angstrom per interazioni elettrostatiche a lungo raggio, abbassare gradualmente il limite dell'atomo di soluto a 0,1 kilocalorie per mole angstrom quadrato e finalizzare l'equilibrazione con una simulazione senza freni di cinque nanosecondi. Eseguire l'equalizzazione con il comando come indicato.
Regolare il testo per consentire l'esecuzione della simulazione di produzione per 100 nanosecondi con le conformazioni salvate ogni 10 picosecondi, quindi eseguire la simulazione con il comando come indicato. Per visualizzare l'esempio di conformazione durante le simulazioni di chinasi EGFR di tipo selvaggio e mutante, aprite i file della topologia Amber e i corrispondenti file di traiettoria in Visual Molecular Dynamics. E usando comode rappresentazioni della struttura secondaria, analizzare la dinamica strutturale complessiva delle proteine dalla traiettoria registrata.
Quindi visualizzare interazioni specifiche tra atomi e residui di interesse, come la lisina cataliticamente essenziale 745-glutammato 762 ponte salato. In alternativa, salvare più conformazioni campionare durante la simulazione in formato Protein Data Bank e aprire le conformazioni in Kymera. Utilizzate l'opzione matchmaker per sovrapporre le strutture alla struttura iniziale o mediana e visualizzare la struttura mediana in solido e il resto delle strutture allineate in bianco sbiadito per consentire la visualizzazione dei movimenti strutturali registrati con maggiore chiarezza.
Per analizzare la stabilità globale degli EGFR di tipo selvaggio e mutante e per esaminare la flessibilità delle diverse unità strutturali, importare la tipologia Ambra e i corrispondenti file di traiettoria. Nel file di input della deviazione quadratica media radice, indicare gli atomi dorsali della struttura iniziale come riferimento per il raccordo quadrato medio radice. Nel file di input di fluttuazione quadratica media della radice, indicare gli atomi C-alfa della struttura iniziale come riferimento per il raccordo quadrato medio della radice.
Quindi eseguire l'analisi con il programma CPPTRAJ e tracciare i dati di output. In alternativa, per allineare gli insiemi conformazionali e colorare ogni residuo in base alla deviazione quadratica media della radice atomica C-alfa, aprire le conformazioni in Kymera e allinearle all'opzione matchmaker. Selezionare gli strumenti, la rappresentazione e il rendering in base all'attributo.
Selezionate i residui degli insiemi conformazionali e impostate la deviazione quadratica media della radice C-alfa come attributi, quindi fate clic su OK. La traccia a catena delle conformazioni sarà colorata di blu, bianco o rosso riflettendo rispettivamente le regioni di stabilità strutturale alta, media e bassa. Per analizzare le interazioni del legame idrogeno tra ATP e FEG sia di tipo selvaggio che di eliminazione, preparare uno script CPPTRAJ per svolgere questo compito. Specificare l'analisi per i legami idrogeno intermolecolari solo con la variabile nointramol e definire un legame idrogeno con una distanza accettore donatore inferiore o uguale a 3,5 angstrom e un angolo di legame maggiore o uguale a 135 gradi.
Per valutare le interazioni intramolecolari, ad esempio, tra i residui di lisina e glutammato cataliticamente importanti, specificare la lisina come donatore di idrogeno e il glutammato come residui accettori ed eseguire la scrittura come indicato per consentire l'analisi del risultato. Per calcolare le energie libere di legame tra ATP e EGFR sia di tipo selvaggio che di eliminazione, preparare il recettore del ligando in fase gassosa e il complesso di recettori dei ligandi Protein Data Bank file nel programma LEAP e impostare ATP come ligando ed EGFR come recettore. Impostare il valore radio nato generalizzato su M Bond I2. Quindi generare la topologia Amber e i file di coordinate per i file Protein Data Bank in fase gassosa.
Allo stesso modo, per calcolare le energie libere di legame tra l'attivatore e le chinasi riceventi di tipo selvaggio e alanina 702 EGFR valine, specificare la chinasi del ricevitore come ligando e l'attivatore chinasi come recettore e salvare i corrispondenti file di topologia e coordinata. Preparare un file di input della superficie nato generalizzato della meccanica molecolare e impostare il valore IGB su due e la salina su 0,1. Quindi usando la mmpbsa.
py disponibile in Ambra, immettere il comando come indicato per eseguire i calcoli dell'energia di associazione e analizzare i dati di output. Durante questa simulazione rappresentativa di 100 nanosecondi, il mutante vascolare alanina 702 mostrò una maggiore stabilità conformazionale del segmento B della giustatamembrana probabilmente a causa di interazioni idrofobiche più strette rispetto all'EGFR di tipo selvaggio. Il mutante vascolare alanina 702 mostrava anche una minore energia libera di legame tra l'attivatore e la chinasi del ricevitore rispetto all'EGFR di tipo selvaggio, che rappresentava interazioni dimeri più favorevoli che mantengono la conformazione attiva della chinasi EGFR.
La simulazione della mutazione di eliminazione ha portato a fluttuazioni atomiche C-alfa inferiori dell'alfa C-elica funzionalmente chiave rispetto all'EGFR di tipo selvaggio, prolungando il tempo dello stato attivo EGFR. La mutazione della cancellazione ha anche portato alla frequente formazione di legami idrogeno tra gli atomi polari a catena laterale della lsina 745 e il glutammato 762, un'interazione chiave per l'attività enzimatica EGFR rispetto all'EGFR di tipo selvaggio. Inoltre, il numero di legami idrogeno tra ATP ed EGFR era maggiore per il mutante di cancellazione che per l'EGFR di tipo selvaggio.
La mutazione della cancellazione ha anche portato ad un movimento verso l'interno dello stato inattivo EGFR alfa C-elica, un cambiamento strutturale previsto durante la transizione allo stato attivo. Al contrario, l'alfa C-elica dell'EGFR inattivo di tipo selvaggio mantenne la sua conformazione iniziale. Per valutare l'impatto delle mutazioni, è fondamentale selezionare gli stati conformazionali appropriati delle strutture e preparare ed equilibrare correttamente queste strutture.
È importante combinare simulazioni dinamiche molecolari con studi sperimentali in quanto la sinergia tra queste tecniche avvantaggia l'interpretazione dei risultati e può informare ulteriori esperimenti di laboratorio umido.
