Moleküler dinamik simülasyon moleküler hareketleri keşfetmek için kullanılabilecek ve biyokimyasal ve hücresel fonksiyonu anlamak için çok önemli konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkarabilir bir hesaplama tekniğidir. Makromolekülün erişebildiği dinamik hareket aralığını araştırmak zordur. Moleküler dinamik simülasyonların sonuçlarının deneysel verilerle birlikte kullanılması, bunların işlevsel öneminin değerlendirilmesine olanak sağlar.
Kanser hastalarında gözlenen mutasyonların EGFR hedefleme onaylarını ve ligand bağlanmasını nasıl etkilediğini moleküler dinamik simülasyonlar kullanarak göstereceğiz. Yabani tip apo aktif EGFR'yi hazırlamak, kinaz yapımızı açmak, Kymera görselleştirme programını açın ve dosya menüsünün altında ID.Select Protein Veri Bankası veritabanını seçin ve Protein Veri Bankası 2GS2 kodunu belirtin. Eksik yapısal 2GS2 elemanları oluşturmak için, diğer EGFR yapılarından bu segmentleri elde.
EGFR'de alanin 750 ELREA silme için beş kalıntı glutamat 746 oluşturmak için, vahşi tip 2GS2 sırasını açmak için sık kullanılan, sıralı ve gösteri sırasını tıklatın. Ve ortaya çıkan sıra penceresinde, tıklayın ve silme mutant FASTA biçim sırasını seçmek için sıra ekleyin. Hizalama penceresinde, yapı ve model veya homoloji seçin.
Açılır pencerede, 2GS2 bileşik yapısını şablon olarak ve mutant sırasını modellenecek sorgu olarak belirtin, ardından zDOPE puanına ve görsel incelemeye dayalı olarak ortaya çıkan modellerden bir mutant modeli seçin. Yabani tip apo inaktif EGFR kinaz yapısını hazırlamak için Protein Veri Bankası yapısını 2GS7 açın ve diğer EGFR yapılarından eksik segmentleri ekleyerek silme mutant formunu nmodela edin. ATP'ye bağlı yabani tip aktif EGFR kinaz yapısını hazırlamak için, protein veri bankası yapısını temel yapı olarak kullanın, diğer EGFR yapıları kullanılarak eksik segmentleri oluşturmak ve modelleyiciyi kullanarak silme mutant formunu modellemek.
Yabani tip EGFR asimetrik dimer yapısını oluşturmak için, Kymera'da 2GS2'yi açın ve araçları, yüksek sıralı yapıyı ve birim hücreyi asimetrik düzenlemede aktivatör ve alıcı kinazlarını içeren biyolojik montaja dönüştürün. 2GS2 yapısını seçin ve kopyaları girin, ardından simetri işlemlerinden kaynaklanan dimer'ın birden fazla kopyasından tek bir asimetrik dimer seçin ve kaydedin. Alanine 702 valine mutant oluşturmak için, valine alanine 702 yerine araçları seçin, yapı düzenleme ve rotamers.
Maestro'daki yapıları açın ve protein hazırlama sihirbazı düğmesini tıklayın, sonra hidrojen atomları ekleyin ve eksik yan zincir atomlarını doldurun ve ön işlem tıklayın. pH 7.0'daki iyonizebilir kalıntıların protonasyon durumlarını belirlemek için, asparagin, glutamin ve histamin kalıntılarının hidrojen bağlanması için yönünü optimize etmek için PROPKA'yı hassaslaştır'ı tıklatın ve sonra yapıyı en aza indirin. Simülasyon sistemini kurmak için LEAP programını açın ve Amber FF14SB kuvvet alanını ve TIP3P su moleküllerini ithal edin.
ATP'ye bağlı sistemler için, ATP için alma parametreleri ve yapıyı yükleyin. Proteinin yüzey atomlarından her yöne 10 angstrom uzanan açık TIP3P su molekülleri ile bir sekizahedral kutu içinde yapısı solvate. Kemer sistemini kontrol edin ve nötralize etmek için gerekli iyonları ekleyin.
Biyomoleküler sistemleri yeterince modellemek için, sistem tuz konsantrasyonu 0,15 molar getirmek için simülasyon kutusuna ek sodyum ve klorür atomları ekleyin, sonra oluşturmak ve sonraki üretim simülasyonu için girdi olarak hizmet vermek için sistemin topoloji ve koordinat dosyaları kaydetmek. Amber kullanarak, başlangıçta enerji herhangi bir olumsuz yapılandırmaları atlatmak için simülasyon sistemi en aza indirmek. En küçük leştirme girişi dosyasında, en dik iniş algoritmasının döngü sayısını belirtmek için toplam en küçük leştirme döngüsü ve döngü sayısı için maksimum döngü değişkenini ayarlayın.
Emniyet maskesi parametresi tarafından belirtilen solute atomlara kısıtlama kuvveti uygulamak için kısıtlama ağırlığı değişkenini kullanın. Mol angstrom kare başına 25 ila 0 kilokalori solute atomlar uygulanan kısıtlama yavaş yavaş düşürerek, birden fazla adımda en aza indirme yürütmek, sonra en aza indirme çalıştırmak için komutu kullanın. Sistemi 0'dan 300 Kelvin'e kadar 100 pikosaniye ısıtın ve solute atomlar üzerinde kare angstrom kısıtlaması başına 10 kilokalorilik azı mili ayarlamak için komutları kullanın.
Sonra ısıtma yürütmek için komutu kullanın. Sistemi izobarik bir topluluk altında 900 pikosaniye için dengeleyin ve uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için dokuz angstrom mesafesi kesiği ayarlayın, solute atom kısıtlamasını yavaş yavaş mol angstrom kare başına 0,1 kilokaloriye düşürün ve dizginsiz beş nanosaniyelik bir simülasyonla dengeyi kesinleştirin. Belirtilen komutla eşitleme çalıştırın.
Her 10 pikosaniyede bir kaydedilen konformasyonlarla üretim simülasyonuna 100 nanosaniye boyunca yapılmasına izin verecek şekilde metni ayarlayın ve simülasyonu belirtildiği gibi komutla çalıştırın. Vahşi tip ve mutant EGFR kinaz simülasyonları sırasında konformasyon örneğini görselleştirmek için Amber topoloji dosyalarını ve Visual Molecular Dynamics'teki ilgili yörünge dosyalarını açın. Ve uygun ikincil yapı gösterimleri kullanarak, kaydedilen yörüngeden proteinlerin genel yapısal dinamiklerini analiz edin.
Daha sonra atomlar ve ilgi artıkları arasındaki belirli etkileşimleri görüntüleyin, katali esansiyel lisin 745-glutamat 762 tuz köprüsü gibi. Alternatif olarak, Simülasyon sırasında alınan birden fazla konformasyonu Protein Veri Bankası formatında kaydedin ve Kymera'daki konformasyonları açın. İlk veya ortanca yapıdaki yapıları üst üste beklemek ve kaydedilen yapısal hareketlerin daha net bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlamak için, ortayapıyı katı ve hizalanmış yapıların geri kalanını soluk beyaz olarak görüntülemek için çöpçatan seçeneğini kullanın.
Vahşi tip ve mutant EGF'lerin küresel kararlılığını analiz etmek ve farklı yapısal birimlerin esnekliğini incelemek için Amber tipolojisini ve buna karşılık gelen yörünge dosyalarını ithal edin. Kök ortalama kare sapma giriş dosyasında, kök ortalama kare uydurma için referans olarak ilk yapının omurga atomları gösterir. Kök ortalama kare dalgalanma giriş dosyasında, kök ortalama kare uydurma için referans olarak ilk yapının C-alfa atomları gösterir.
Ardından CPPTRAJ programı yla analizi çalıştırın ve çıktı verilerini çizin. Alternatif olarak, konformasyonel toplulukları hizalamak ve C-alfa atom kökü ortalama kare sapmadayalı her kalıntı renklendirmek için, Kymera konformasyonları açın ve çöpçatanlık seçeneği ile hizalamak. Araçları, tasviri ve öznitelik ile işlemeyi seçin.
Konformasyonel toplulukların artıklarını seçin ve C-alfa kökü ortalama kare sapması öznitelikleri olarak ayarlayın, sonra Tamam'ı tıklatın. Konformasyonların zincir izi sırasıyla yüksek, orta ve düşük yapısal kararlılık bölgelerini yansıtan mavi, beyaz veya kırmızı renkte olacaktır. ATP ile hem vahşi tip hem de silme EGF'leri arasındaki hidrojen bağı etkileşimlerini analiz etmek için, bu görevi yerine getirmek için bir CPPTRAJ komut dosyası hazırlayın. Moleküler hidrojen bağlarının analizini sadece nointramol değişkeni ile belirtin ve donör kabul mesafesi 3,5 angstrom'dan daha az veya eşit ve 135 dereceden daha büyük veya eşit bir bağ açısına sahip bir hidrojen bağı tanımlayın.
Örneğin katalitik olarak önemli lizin ve glutamat artıkları arasındaki moleküler etkileşimleri değerlendirmek için, lizini hidrojen donör ve glutamat olarak kabul edici kalıntılar olarak belirtin ve sonucun analizini sağlayacak şekilde komut dosyasını çalıştırın. ATP ile hem yabani tip hem de silme EGFR'leri arasındaki bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için, LEAP programında gaz fazı ligand reseptörü ve ligand reseptör kompleksi Protein Veri Bankası dosyalarını hazırlayın ve ATP'yi ligand ve EGFR reseptör olarak ayarlayın. Genelleştirilmiş radyo değerini M Bond I2 olarak ayarlayın. Sonra Amber topolojisi oluşturmak ve gaz faz Protein Veri Bankası dosyaları için dosyaları koordine.
Benzer şekilde, yabani tip ve alanin 702 valine EGFR aktivatör ve alıcı kinazları arasında bağlayıcı serbest enerjileri hesaplamak için, alıcı kinaz'ı reseptör olarak ligand ve aktivatör kinaz olarak belirtin ve ilgili topolojiyi ve koordinat dosyalarını kaydedin. Moleküler mekaniği genelleştirilmiş bir yüzey alanı giriş dosyası hazırlayın ve IGB değerini ikiye, saltcon'u ise 0,1'e ayarlayın. Sonra mmpbsa kullanarak.
py script Amber mevcuttur, bağlayıcı enerji hesaplamaları yürütmek ve çıkış verilerini analiz etmek için gösterildiği gibi komutu girin. Bu temsili sırasında 100 nanosaniye simülasyon, alanine 702 valine mutant yabani tip EGFR ile karşılaştırıldığında sıkı hidrofobik etkileşimler nedeniyle büyük olasılıkla yan yana B segmentinin artmış konformasyonel stabilite gösterdi. Alanine 702 valine mutant da aktivatör ve alıcı kinases vahşi tip EGFR göre arasında bağlayıcı daha düşük bir serbest enerji sergiledi, aktif EGFR kinaz konformasyon korumak daha olumlu dimer etkileşimleri temsil eden.
Silme mutasyonunun simülasyonu, işlevsel olarak anahtar alfa C-sarmalının vahşi tip EGFR'ye göre daha düşük C-alfa atom dalgalanmalarına yol açarak EGFR aktif durumunun süresini uzattı. Silme mutasyonu ayrıca, egfr enzimatik aktivitesi için yabani tip EGFR'ye kıyasla önemli bir etkileşim olan lizin 745 ve glutamat 762 yan zincir polar atomları arasında sık hidrojen bağları oluşmasına neden oldu. Ayrıca, ATP ve EGFR arasındaki hidrojen bağlarının sayısı silme mutantı için vahşi tip EGFR'ye göre daha fazlaydı.
Silme mutasyonu aynı zamanda EGFR inaktif durum alfa C-helis, aktif duruma geçiş sırasında beklenen yapısal bir değişiklik içe doğru hareket sonuçlandı. Buna karşılık, vahşi tip inaktif EGFR alfa C-sarmal ilk konformasyon korudu. Mutasyonların etkisini değerlendirmek için yapıların uygun konformasyonel durumlarını seçmek ve bu yapıları düzgün bir şekilde hazırlamak ve denedirmek önemlidir.
Bu teknikler arasındaki sinerji sonuçların yorumlanmasına fayda sağladığından ve ek ıslak laboratuvar deneylerini bilgilendirebildiği için moleküler dinamik simülasyonları deneysel çalışmalarla birleştirmek önemlidir.
