该方法提供了关于如何通过分化为最终内胚层，然后是后肠上皮，最后转移到 3D 培养条件来产生人类诱导的多能干细胞衍生的肠道类器官的分步说明。从人诱导的多能干细胞来源的肠道类器官获得的结果显示出比单细胞培养物数据更大的可翻译性，同时也比原代组织来源的类器官更实用，后者可能难以长期保存在培养物中。从分化的 iPSC 产生人肠道细胞后，使用 5 毫升血清移液器从 6 孔板的每个孔中分离细胞单层。
并将细胞汇集在单个 15 毫升管中进行离心。将沉淀重新悬浮在补充有生长因子的肠道生长培养基中。并根据被铺板的孔数加入适当体积的细胞外基质。
将 30 微升细胞悬液加入 48 孔板的适当数量的孔的中心。确保将ECM放置在孔的中心对于样品的长期稳定性非常重要。如果ECM接触到井壁，它可能会坍塌，样品可能会丢失。
将板放入细胞培养箱中至少 5 分钟。当细胞外基质凝固后，向每个孔中加入300微升补充有生长因子的新鲜肠道生长培养基，并将板放回细胞培养箱中。48小时后，使用光学显微镜检查孔的类器官形成。
培养 7 天后，吸出培养基并用冰冷的 DPBS 代替。使用 5 毫升血清移液管将类器官和细胞外基质球从板上机械分离。然后，将类器官汇集到单个 15 毫升离心管中。
通过离心收集类器官并将上清液吸到可见ECM层的顶部。将沉淀重悬于15毫升冰冷的DPBS中，然后再次离心细胞。如图所示吸出上清液后，将沉淀重悬于1毫升冰冷的PBS中，并使用P200移液器手动破坏完整的类器官。
确认类器官完全解离。如图所示，旋转解离的类器官并重新悬浮在所需体积的细胞外基质中，然后接种到新鲜的 48 孔板上。然后，将板放回培养箱 5 分钟。
5分钟后，从培养箱中取出板，加入含有生长因子和ROCK抑制剂的肠道基础培养基。每 2-4 天更换一次介质。为了触发肠道类器官的炎症反应，用 300 微升新鲜制备的基础培养基替换类器官培养物中每个孔中的上清液，该培养基补充有 40 纳克/毫升 TNF α。
然后，将板放回细胞培养箱 48 小时以复制促炎环境。在人类IPSC分化过程中，可以使用多能性标志物监测基因表达，这些标志物在第0天高度表达，并在最终内胚层分化过程中迅速下调。在分化的第 2 天，确定的内胚层基因应开始表达，表达应在第 3 天达到峰值。
在后肠规范期间，应诱导 CDX2 和 HNF4alpha 表达并随着时间的推移而增加。2D 细胞片转移后 48 小时，细胞片应开始自动组织成更紧凑的 3D 球状体结构，这些结构最初很小，但在接下来的 7-10 天培养中逐渐增加大小和复杂性。类器官在获得具有明显上皮且管腔朝向结构中心的清晰类器官球状体形态之前，不应传代。
当结构达到这一阶段时，可以进行免疫细胞化学以确认肠道标志物的表达，例如绒毛和 CDX2。为了模拟炎症，可以将 TNF α 添加到组织培养基中 24-48 小时，这通常会导致促炎标志物的表达以及肠上皮标志物的下调。人诱导的多能干细胞来源的肠道类器官可用于药物发现、疾病建模、基因编辑、肿瘤微环境研究以及任何感兴趣的疾病的转录组学和蛋白质组学以及表观遗传学特征。
这种方法可以帮助许多实验室建立肠道类器官作为模型系统，为他们的研究提供额外的方法。
