该方法是细胞生物学领域的一种有价值的工具，用于评估使用荧光探针在体外培养为类器官的活原代细胞中的细胞ROS水平。该技术的主要优点是ROS可以通过显微镜在完整的肠道类器官中定性地可视化，并使用96孔板的流式细胞术在解离细胞中进行定量分析。该方法可以应用于其他类器官模型，并且可以使用替代荧光传感器来分析不同的细胞途径。
在首次应用该协议之前，实验者应熟悉类器官培养和传代。虽然我们的实验方案非常适合筛选方法，但初学者应该从几个样本开始。演示该程序的将是实验室的工程师Sophie Dulauroy。
在牺牲一只8至10周龄的Lgr5-GFP小鼠后，收集十二指肠和回肠之间空肠周围区域的5至8厘米，并将其置于冰上补充抗生素的冷DPBS中。接下来，通过用含有抗生素的5至10毫升冷DPBS冲洗来清洁肠道内容物。然后使用球尖剪刀，纵向打开肠道，并使用镊子将组织转移到含有抗生素的冷DPBS的培养皿中。
摇动培养皿内的纸巾以冲洗干净。接下来，使用塑料巴斯德移液器通过抽吸抓住肠道，并将其转移到含有10毫升冷10毫摩尔EDTA的15毫升管中。将管倒置三次，并在冰上孵育10分钟。
孵育后，将组织转移到含有10毫升DPBS的管中并涡旋两分钟。立即在培养皿中加入10微升馏分，并使用显微镜评估馏分的质量。在DPBS中进行两次转移后，每次转移之间有两分钟的涡旋管，如前所述，将EDTA中的肠在冰上孵育五分钟。
在含有DPBS的试管中连续转印三次后，每次转印之间涡旋三分钟，通过将选定的试管倒置三次并通过70微米细胞过滤器过滤，将最佳馏分混合到50毫升管中。然后旋转隐窝，丢弃上清液并机械破坏沉淀，然后加入五毫升冷DMEM F12。在显微镜下手动计算10微升等分试样中存在的隐窝数量。
计数后，再次旋转隐窝并小心地除去上清液。然后机械地破坏沉淀并将生长培养基加入管中，以获得每微升90隐窝的浓度。接下来，加入两体积的未稀释的基底膜基质或BMM，以获得每微升30个隐窝的最终浓度，并小心地上下移液悬浮液，而不会将气泡引入混合物中。
对于流式细胞术分析，将10微升的隐窝BMM板混合为预热的圆底96孔板的每个孔中心的圆顶。对于成像，将10微升的混合物作为薄层沉积在预热的微滑梯八孔室中。让BMM在室温下凝固五分钟后，将板置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。
15分钟后，将250微升生长培养基加入每个孔中，注意不要分离BMM，并将板放入培养箱中。为了通过共聚焦显微镜观察氧化应激，在镀有类器官的微滑八孔室的相应孔中加入一微升n-乙酰半胱氨酸储备溶液。孵育一小时后，在相应的孔中加入一微升叔丁基过氧化氢储备溶液，再孵育30分钟。
接下来，每孔加入1.25毫摩尔稀释的荧光探针的一微升，然后加入每毫升1.25毫克Hoechst溶液的一微升。再孵育30分钟后，在不干扰BMM的情况下取出培养基，并轻轻加入250微升温热的DMEM，不含酚红。使用配备热室和气体供应的共聚焦显微镜对类器官进行成像，以检测荧光探针。
使用正对照，设置ROS信号的激光强度和时间曝光，并检查该信号在负对照中是否较低。接下来，使用目镜筛选载玻片以识别表达GFP的类器官并调整激光强度。设置一个25微米的z-stack并定义位置以获得整个类器官的拼接图像，以获得显示一层细胞的类器官的一部分。
在含有类器官的96孔圆形底板的阴性对照孔中加入一微升的n-乙酰半胱氨酸储备溶液。孵育一小时后，在相应的孔中加入一微升叔丁基过氧化氢储备溶液，孵育30分钟。然后使用多通道移液器，在不干扰附着的BMM的情况下取出培养基，并将其转移到另一个96孔圆形底板上。
把这个盘子放在一边。接下来，加入100微升胰蛋白酶，使用多通道移液器，上下移液五次，以破坏BMM。短短的五分钟孵育后，通过第二次上下移液来解离类器官。
旋转板并通过反转板来丢弃上清液。将先前在另一个96孔板中收集的培养基重新加入相应的孔中，并通过上下移液五次来重悬细胞。接下来，加入一微升荧光探针并孵育30分钟。
然后再次旋转板并用250微升DAPI溶液重悬细胞。将样品转移到流式细胞术管中，并将试管保持在冰上。使用单色样品优化未染色控制和激光电压的正向和侧面散射电压设置，适用于每个荧光团。
然后使用适当的门控策略，收集至少 20， 000 个事件。ROS染色和类器官的代表性共聚焦图像显示，在NAC抑制剂存在下，只有来自类器官管腔中含有的死细胞的信号是可见的。在未经处理的类器官中，可以看到基础ROS水平，特别是在GFP阳性细胞中，证明干细胞产生的ROS高于分化细胞。
GFP阳性细胞在荧光探针存在下通过诱导剂呈现更显着的细胞质信号，表明ROS水平在治疗后特别在干细胞中增加。肠道类器官中ROS产生的流式细胞术分析表明，用抑制剂刺激后基础ROS水平降低，用诱导剂激发后增加。用抑制剂预处理然后用诱导剂刺激的细胞比单独用诱导剂刺激的细胞存在更低的水平。
对门控为GFP阳性的干细胞的类似分析显示，与非刺激细胞相比，抑制剂处理后ROS水平降低3.5倍，诱导剂处理后增加4倍。当尝试这个过程时，用户应该记住在类器官操作和解离期间限制细胞应激。此外，在分析 ROS 时，应始终包括阳性和阴性对照。
按照该程序，分析可以通过对固定的完整类器官进行免疫荧光染色，细胞分选和基因表达分析来补充，以获得有关ROS调控的其他见解。观看此视频后，您应该知道如何生长小鼠肠道类器官，对完整的类器官进行实时成像分析，并处理肠道器官以进行流式细胞术分析。
