肠道维利表皮的器官3D培养进行分化

这种方法可以确认在体内获得干细胞标记的去分化上皮的器官形成能力。villi 的收集是通过刮擦而不是 EDTA 溷合方法进行的，方法可防止潜在的介质完全丧失，如果器官启动需要，这些夹层可能会提供利基信号。这种方法适用于上皮组织，其中增殖和分化隔间被物理划定，去分化细胞在体内表达干细胞标记。

本协议中的某些因素需要经验确定，包括收获葡萄糖的最佳阶段和刮葡萄糖的最佳压力，这需要时间和实践。连续四天通过腹内注射塔莫西芬和玉米油，诱导突变小鼠的Smad4敲除和β-卡特宁功能突变增益。对小鼠实施安乐死后，用70%乙醇喷洒腹部，以防止老鼠毛皮进入腹腔。

用解剖剪刀打开腹腔，露出肠道，用剪刀和钳子隔离肠道。分解十二指肠的近半部分，然后用5毫升冰冷PBS在10毫升注射器中冲洗十二指肠，以清除亮性含量。用斜剪刀纵向打开十二指肠，将十二指肠平放在冰上15厘米的培养皿上，十二指肠的流明朝操作者。

在开始刮擦之前，在六井组织培养板的一口井中放置一个70微米的网状过滤器。用四毫升1X PBS填充所有油井，并将板放在冰上。用两个微小的玻璃滑梯刮擦玻璃片，一个用来压住十二指肠，另一个用来刮。

刮十二指肠的发光侧表面两次，以消除粘液不删除维利，然后刮十二指肠两次，以收集幻灯片上的葡萄球，而不系绳的墓穴。使用含有 PBS 的一毫升转移移液器将 villi 转移到六井盘中的 70 微米网状过滤器中。每次刮伤后收集维利。

为了去除松散的地窖，通过将过滤器通过六井盘中的一系列井（每口油井含有四毫升冰冷 PBS）中的一系列井，用 70 微米滤网清洗收集的 villi。使用 P1000 移液器，将大约 3 毫升 PBS 中的 villi 悬浮液从 70 微米滤网转移到冰上新的 15 毫升管。使用 0.1% BSA 涂层的钝端 P200 移液器尖端将 50 微升的 villi 悬架体积转移到玻璃滑梯上。

计算 4 倍放大倍数下 50 微升液滴中的维利数，以确定 PBS 悬架中维利的浓度，并确认没有系绳的暗箱。要平板 villi，请使用 0.1% BSA 涂层的 P200 钝端移液器尖端将 villi 转移到微中心管中，在 BME-R1 矩阵的 12.5 微升中将每口井的电镀密度为 6 维利。在摄氏4度200度时旋转两分钟。

取出超高纳特并重复离心以去除任何残留的 PBS。在层压流罩中，将维利颗粒轻轻地重新沉积在冰上解冻所需的冷 BME-R1 量中。使用P20移液器，在BME-R1基质中，每口96井U底板的villi板12.5微升预热至37摄氏度。

在37摄氏度的组织培养培养器中孵化板15分钟，使BME-R1基质凝固。在每口井中，添加 125 微升预热 ENR 介质，并补充文本手稿中描述的。在37摄氏度的组织培养孵化器中用5%的二氧化碳孵育镀的维利，每隔一天更换一次介质。

丢弃任何在两天前出现器官的井。从墓穴中浮现的器官与同一小鼠肠中去分化的上皮在外观上是有区别的。加密衍生的器官在一夜之间以具有明确边界的球形结构出现。

检查了从维利开始的器官的动力学和形态外观，这些器官最初看起来形状不规则，需要两到五天才能在显微镜下看到。从两个不同的维利的有机启动显示。具有器官形成潜力的病毒似乎密集，可能是由于基础粘膜的保留。

从别墅的有机启动是明显的第二天从维利之一。而在其他别墅，风琴出现在第四天。在收获病毒和种植由此产生的器官时，采取适当步骤避免墓穴污染至关重要。

在此过程之后，观察了从同一突变体的切口中产生的器官和病毒之间的表型差异，因此可以进行进一步的实验，以寻找两者之间的分子差异。本协议可用于研究内源性密码产生的器官与非分化产生的异位性密码之间的差异，从而可以解决去分化的影响。