将伽马改性肽核酸自组装成有机溶剂混合物中复杂的纳米结构

这种新颖的协议描述了使用多种不同序列的合成核酸模仿伽马PNA形成纳米结构在特定的有机溶剂混合物。此处描述的测定表明，需要将现有的核酸纳米技术协议调整为有机溶剂，而有机溶剂很少或没有发布。由于纳米材料PNA具有聚合的倾向，新接触这项技术的从业者可能会发现，很难将为水富环境开发的现有协议适应有机溶剂丰富的环境。

首先准备伽马PNA库存。从一家商业制造商那里获得 HPLC 级纯化伽马 PNA 链后，将去化水中的每股重新暂停至 300 微摩尔浓度。将伽玛 PNA 储存在零下 20 摄氏度，长达数月。

当准备执行自组装时，在 75%DMSO、75%DMF 和 40%1、4-二恶烷中准备退火批次样品。首先，从主库存中加入0.67微升，加入除离子水，最终为10微升，为每个寡聚物准备20微摩尔子。将20微摩尔子库存中每个寡聚物的微升添加到200微升PCR管中，9个寡聚物的总体积为9微升。

添加 30 微升无水 DMSO 或 DMF，再加一微升去维水，最终体积为 40 微升。要准备40%1，4二氧烷批次，加入16微升1，4-二氧烷，并带体积到40微升与去电化水。在 90 至 20 摄氏度的热循环器冷却中，将样品退去 22.5 小时。

通常，两个寡聚物和三个寡聚伽马 PNA 子集的熔化温度在 40 至 70 摄氏度的范围内，用于不同的溶剂条件。根据手稿指示对热循环器进行编程。退火完成后，样品可以在4摄氏度下储存12至24小时，然后进行表征。

通过将大约五毫升的水填充到包装盒中，从空移液器提示盒中制作一个湿度室。用乙酰醋酸酯溶剂准备20倍的商用2%的醋酸胺醇稀释，以产生硝基纤维素溶液。使用钳子将盖玻片浸入硝基纤维素溶液中，使其风干，然后用显微镜幻灯片、两个双面胶带和硝基纤维素涂层盖玻片制作流动室。

通过称量一毫克生物素 BSA 并在 PBS 中溶解它，准备生物素 BSA 溶液。将生物素 BSA 的 15 微升移液器以一定角度进入流通道，并在加湿室的室温下孵育两到四分钟。将洗涤缓冲液的15微升（由1毫升PBS中的1毫克BSA组成）吹入通道，洗去多余的生物素BSA，然后通过在加湿室中孵化流通道2至4分钟来钝化表面。

测量0.5毫克的链球菌素和1毫克的BSA，然后溶解在PBS的一毫升。将链球菌溶液的15微升移液放入流道中，放入加湿室2至4分钟，然后通过流动15微升的洗涤缓冲液清洗通道。接下来，在加湿室中流15微升的退火批次伽马PNA寡聚物，然后以与纳米结构相同的溶剂成分流15微升15微升，清洗未绑定的纳米结构。

将流量通道传输到滑架，使用配备 TIRF 成像、60 倍油浸夹目标和 1.5 倍放大镜的荧光显微镜对它进行成像。在监控 Cy3 通道时，以 60 倍或 90 倍的放大率扫描流量通道。根据手稿方向准备 20 和 6% SDS 库存，然后将伽马 PNA 寡聚物退火，将每 20 微摩尔寡聚物中的一微升添加到 200 微升 PCR 管中。

在 PCR 管中加入 30 微升无水 DMSO 和一个 6%或 20%SDS 微升，最终体积为 40 微升，最终 SDS 浓度将分别达到 5.25 或 17.5 毫摩尔。如前面所述，将热循环器中的伽马 PNA 退火。使用 TIRF 或 TEM 协议在存在 SDS 的情况下描述伽马 PNA 纳米结构。

75% DMSO 中退火的伽马 PNA 寡聚物的 TIRF 成像显示结构良好，而 75% DMF 的退火则产生了尖刺状或针状纳米结构。40%1，4-二氧烷条件产生了丝丝纳米结构的稀疏装饰。此外，在 75% DMSO 中形成的伽马 PNA 纳米管的样本表明，在 TEM 成像过程中，纳米纤维以高放大倍率或纳米分辨率捆绑在一起。

对纳米结构宽度的定量分析表明，中位宽度为16.3纳米，最大值超过80纳米。取代连续伽马PNA的异质DNA寡聚物形成直丝结构，而交叉伽马PNA的替代则产生硬质结构。被连续DNA寡聚物取代的纳米结构的中位宽度约为19纳米。

在高 SDS 浓度下，伽马 PNA 纳米纤维在使用 TIRF 成像时，也采用高度网络化形态，而与其关键的 micelle 浓度相比。TEM 成像表明，5.25 毫摩尔 SDS 中的伽玛 PNA 组件在结构捆绑方面具有最大的缩减。在尝试此协议时，重要的是要记住保持上述溶剂组合物，因为纳米结构有聚合的倾向。

这些方法鼓励从业者探索其他未探索的不同溶剂组合物、表面活性剂和其他PNA DNA纳米结构的途径。