CRISPR-Cas9-中切基因组编辑在纤维阿莫西特 亨蒂埃拉阿曼尼西斯

我们的协议意义重大，因为它允许研究非模型真菌的研究人员有机会在他们的实验室中建立尖端的基因组编辑技术。由于它不依赖于现有的技术，如表达式系统，此协议的优点是更容易在非模型系统中建立。该方法可用于不同的真菌物种，并可用于阐明涉及通路交配、生长和致病性的基因的功能。

因此，在执行此过程时，必须确保有足够连续天数来竞争协议，因为在实验中只有几点可以暂停。要收获锥形，请通过一层无菌实验室布过滤液体培养，制成50毫升离心管进行离心。将锥形颗粒重新用五毫升水中重新发送，并在光学显微镜下以 40 倍的放大率查看锥形溶液的 10 微升等分，以确认只回收了锥形溶液。

接下来，将200毫升新鲜1%麦芽提取物汤加入500毫升的烧瓶中，并将整个体积的康尼迪亚转移到烧瓶中。然后在25摄氏度的震动培养箱中孵育液体培养，以每分钟120转的速度孵化液体培养。要收获细菌，请将培养物转移到50毫升离心管进行离心，并在一种摩尔索比托的10毫升中重新补充发芽菌。

将一毫升的发芽溶液加入各种浓度的酶溶液中，以每分钟80转的速度在摇动培养箱中孵育孢子酶溶液两到三个小时。要收获原体，请通过一层无菌实验室布过滤酶溶液，并通过离心收集原体。然后小心地将原生颗粒重新在 200 微升 STC 缓冲液中重新填充，并在显微镜下检查溶液的 10 微升等分，以确认只回收了蛋白质。

要开始转化，将大约五倍十十到六个表层与单体积核糖核蛋白溶液和大约六微克的供体DNA片段。接下来，使用移液器缓慢、均匀地将一毫升新鲜准备好的 30%PTC 溶液滴到原悬浮液上，在原体上形成疏水层，并在室温下孵育溶液 20 分钟。在孵育结束时，在前侧悬浮液中加入五毫升的渗透控制介质，缓慢而轻轻地移液，以彻底混合溶液。

混合后，在摇动的培养箱中孵育原向性溶液，在一夜之间以每分钟80转的速度孵育。第二天早上，将溶液分成五个60毫米的培养板。在每个板中加入10毫升的渗透控制介质，每毫升Hygromycin B补充30微克，然后慢慢旋转每个板混合。

在添加 10 毫升的渗透控制介质之前，先设置第一层 agar，每盘每盘 2 个 2 微克的 Hygromycin B 中，再加 40 微克。在允许设置第二层阿加后，在 25 摄氏度下孵育培养物，直到观察到单个分离物通过两层阿加生长。为了恢复成功转化的分离物，将单个生长能力分离物转移到新鲜麦芽提取物的阿加板中，每毫升 Hygromycin B.To 评估靶向基因破坏对真菌异质性功能的影响，用一种突变菌株和相反交配类型的菌株共同接种新鲜麦芽提取物阿加基。

使用 H.omanensis 时，盖住但不要密封板。将盘子放在室温下七天。在孵化结束时，目视评估性结构的产生。

为了测试突变菌株的同质性，用感兴趣的突变菌株接种新鲜麦芽提取物的麦格介质，并在室温下孵育板一周，如所证明的。为了评估破坏对所研究的真菌的生长速度的影响，将大型无菌移液器尖端的背面插入每个突变和野生类型兴趣菌株的培养边缘，以创建由菌覆盖的加糖塞并接种新鲜麦芽提取物的阿加培养剂。每个区域性类型至少应完成三个复制。

在20摄氏度下生长三天后，测量两个垂直直径下每个板块的生长。用作协议起始材料的 Conidia 允许发芽和生长，直到它们成为年轻的萌芽。请注意，此类成熟 mycelial 链对于降解来说太成熟，不应使用。

当细胞不再有细胞壁时，它们变得非常敏感，对机械干扰和释放圆形的表膜，可以收获用于转化。该协议的成功可以通过突变菌株的表型分析来确认。对于这种突变的MAT 127分离，植被径向增长率显著降低，表明对新型交配基因有一种多益作用。

此外，与在潜伏几天内完成整个性周期的野生型分离物相比，突变分离体无法完成性周期，只产生不成熟的性结构，而这种结构不会产生性孢子。RNA非常敏感，很容易降解。因此，清洁的工作环境和在冰上快速工作对于这次实验的成功都至关重要。

一旦突变分离成功生成，他们就可以进行表型或RNA-seq分析，以适合被描述的基因。