CRISPR/Cas9基因组编辑的半球 藻（ Hübner）的胚胎显微注射和敲除突变体鉴定

棉铃虫是全球最具破坏性的害虫之一。使用CRISPR / Cas9技术的基因组编辑可以进一步研究该生物体中不同基因之间的基因功能和相互作用。该技术的两个主要优点是它具有高特异性并且可随地进行。

为了选择sgRNA靶标，请访问CRISPR在线网站，搜索可能的引导位点和靠近基因五个主要未翻译区域的外显子。将外显子序列输入文本框，然后选择黑猩猩的靶基因组。根据网站的用户手册，为20 BPNGG选择PAM选项，并将其他设置保留在默认参数上。

比较软件中预测的引导序列，并在五个主要未翻译区域附近选择包含一个或两个胍的20个碱基对的引导序列，这些导引序列具有最高的预测效率和最少的不匹配，以提高编辑效率并减少脱靶编辑。对于胚胎制备，从三天大的雄性和两天大的雌性中选择50个健康个体，并将它们混合在干净的网笼中。将一块含有10%糖溶液的湿棉放入笼子中。

用纱布盖住网架，并用橡皮筋固定纱布。将水喷洒在纱布上，使其保持湿润。将一块黑布切成合适的尺寸，并用这块黑布代替湿润的纱布，使游离的卵子位置持续30分钟。

将双面胶带粘贴到显微镜载玻片上。使用镊子，将带有卵的贴片连续粘贴在双面胶带的表面上。按每个贴片的边缘，确保它们牢固地粘在胶带上。

每台显微镜载玻片收集50至100个卵。在显微注射之前，将显微镜载玻片保持在冰上以延缓胚胎的发育。如文本手稿中所述，使用微型移液器拉动毛细管玻璃来准备针头。

使用微型研磨机将针尖研磨成锋利的尖端。通过将两微升商业化的Cas9蛋白和sgRNA加入PCR管中的无RNace水中来制备注射溶液，以获得10微升体积的混合物。通过移液混合，然后将其放在冰上。

设置电子微注射器的参数。使用微量上样器移液器吸头将两微升的混合物装载到针头中，尽可能多地排出针尖中的残余空气。将注射针连接到显微操作器，并确保两个部件之间的紧密连接。

将载玻片放入培养皿中，然后将其放在显微镜的载物台上。小心地将针尖以45度角插入胚胎的上半球。踩踏板将混合物输送到胚胎中，导致胚胎略有膨胀。

立即从胚胎中取出针头，并用一只手移动培养皿，直到下一个胚胎靠近针头。使用相同的程序注射至少300个胚胎，以确保足够的孵化量。注射后盖上培养皿的盖子。

当胚胎的表面颜色变暗时，将人造饮食放在显微镜载玻片周围的培养皿中。准备24孔培养板，并用人工饮食将每个孔填充到其容积容量的1/3。使用小画笔挑选出孵化的幼虫，并将它们转移到24孔培养板中，使得一个孔有一个幼虫。

当幼虫长到第三龄阶段时，将它们转移到新的玻璃延展性乙型。将新封闭的G-zero雄性成虫和野生型雌性成虫以相等的比例转移到新鲜的网笼中。为他们提供10%的糖溶液滴在棉球中。

后部昆虫使用常规方法，直到G-one化蛹。使用镊子小心地取出后腿，并将每条腿放入裂解矩阵管中。使用组织均质器使后腿均质化。

根据制造商的说明，使用商用gDNA提取试剂盒提取均质化样品的基因组DNA。使用基因分型引物和文本手稿中的PCR反应条件扩增基因片段。通过基因测序服务确认基因型。

将相同基因型的G-one个体放入一个网笼中，自我杂交G-one后代并继续使用相同的方法进行筛选。目的基因的目标位点位于其第二个外显子中。该位点高度保守，使用琼脂糖凝胶电泳确认合成sgRNA的目标条带片段。

通过对来自G-one亲本单元的PCR产物进行测序来执行单个sgRNA靶标的突变检测。在不同的外显子上使用非重叠的sgRNA对的有效性得到了证明，因为突变体的大量缺失很容易与野生型平底锅区分开来。在获得一定数量的突变个体后，可以进行电生理或行为实验，以阐明基因功能和不同基因之间的相互作用。