准备单细胞或单核悬浮液是高通量转录组和表观基因组分析的关键步骤。我们的协议为单核分离提供了一种简单、可重复和通用的方法。与其他需要洗涤剂进行核分离的方法相反，我们的协议是基于柱的，即洗涤剂和酶。
它可在30分钟内实现核分离。我们的协议简化了核分离。它提供了一种可靠的方法，用于准备从难以分离的组织的单核悬浮液。
首先，将无洗涤剂核分离套件中的预冷缓冲液 A 和 B 放在冰上至少 30 分钟。涂管和移液器尖端与5%BSA溶液，这将提高核的恢复。要涂覆移液器尖端，移液器 5%BSA 溶液两到三次，然后风干两小时。
要涂覆管子，请用 BSA 填充管，然后反转三次。取出溶液，将管子倒置在干净的纸巾上干燥两个小时。每个样品涂一个收集管和一个 1.5 毫升管。
使用钳子轻轻打破头骨，从头骨的腹和背侧取出软组织、皮肤和骨骼。然后轻轻地将大脑转移到一个30毫米的盘中，里面装着冰冷的PBS，然后用剃刀刀片将大脑切碎成小块。要分离单核，请将碎石组织转移到核分离试剂盒中提供的滤芯中，取出多余的溶液，并加入 200 微升的冷缓冲液 A.用塑料棒研磨组织两分钟。
在滤芯中加入300微升的冷缓冲液，在盖子打开10分钟时在冰上孵育。然后盖上墨盒，然后将管子倒置五次，重新暂停组织。将样品管以16，000倍g离心30秒，使细胞破裂。
流经包含完整的核，在管的底部形成无色颗粒。丢弃过滤器，然后通过大力涡旋 10 秒钟重新暂停颗粒。将溶液以500倍g离心三分钟，再次使核碎块。
然后小心丢弃上一液。将颗粒重新吸收在0.8毫升的冷缓冲B中，通过移液2至3次，以600倍g离心10分钟，将核从膜碎片中分离出来。小心丢弃上看液。
将分离的核用 5%BSA 重新悬浮在 500 微升 PBS 中，并保持悬浮在冰上直到 FACS。要用 HEX 染色确认核形态，请使用 BSA 涂层尖端将单核悬浮液的 100 微升转移到新管中。通过添加0.1微升的六角体，轻轻涡旋管子，使核染色。
使用荧光显微镜将核悬浮液转移到玻璃底盘和核图像，激光激发设置为 405 纳米。在执行 FACS 之前，使用 40 微米细胞滤株将核过滤到 BSA 涂层管中。通过将 PBS 与 5%BSA 一起添加到 1000 微升的最终体积中，稀释过滤的悬架。
使用 BSA 涂层移液器尖端将两个圆底 FACS 管标记为控制和染色，然后将 250 微升的核悬浮液转移到控制管中。将溶液的剩余 750 微升转移到标有染色的 FACS 管中，并添加一个微升的 HEX 染料来染色核。然后通过慢涡混合。
将未污染的控制样本加载到单元格分拣器中并记录 5，000 个事件。然后加载染色样本并记录 5，000 个事件。绘制 FACS 门以识别单核。
通过比较控制和染色样品之间的 HEX 荧光信号，可以选择核。然后将 HEX 正核从染色管中分拣成含有 50 微升 PBS 的新的 1.5 毫升管，具有 5%BSA。该协议用于直接从斑马鱼脑组织产生单核悬浮液。
分离的核被染色的六角热，并用荧光显微镜可视化。他们似乎完好无损，圆圆，并很好地分开。重要的是，没有核聚合。
通过对存在十六进制荧光信号进行浇注，通过流式细胞测量对分离核进行富集。未染色的核显示背景荧光，而染色核则表现出强烈的荧光信号。未染色和染色的核在紫罗兰通道中被很好地隔离。
在尝试此协议时，重要的是要记住，单核往往粘在塑料材料上。为了防止核的潜在损失和提高效率，强烈建议对塑料材料进行基本涂层。分离的单核悬浮液可进一步用于单核RNA此技术阐明复杂生物系统中的细胞异质性，帮助确定细胞亚型和基因网络。
使用洗涤剂和无酶方法记录样品制备过程中引入的技术噪声和偏差。该方法开发了一种简化和后勤的单核分离。
