取自发育研究杂交瘤细胞NICHD的和维护由美国爱荷华大学生物科学系的主持下开发银行（J.多德，TM Jessell和A.川）开发的单克隆抗体（15.3B9，PAX7） ，爱荷华州。 DP是从国家药物滥用研究所露丝Kirschstein奖1F32 DA021977 - 01A1收件人。这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。

一，原理概述： 本视频演示了在整个装载在鸡胚免疫组织化学的不同步骤。首先，胚胎是固定在煤灰[IHC1]。然后淬火，内源性过氧化物酶的活性[IHC2]。胚胎培养中的主要抗体[IHC3]。经过多次洗涤，胚胎是在二抗孵育[IHC4];显色反应显示使用民建联[IHC5并出现抗体染色橙[IHC6]。 <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="图1" width="600" height="573" />第1部分：固定的胚胎<ol><li>要执行整装免疫组织化学鸡胚，首先打开一个鸡蛋，攻壳钳和消除件的外壳。 </li><li>删除与钳厚白蛋白，粗钳倾斜卵黄囊使胚胎朝上。 </li><li>用细剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。从蛋黄用勺子取出胚胎，并在含有PBS菜的地方。 </li><li>一个夹层显微镜下，小心地取出膜，蛋黄和胚胎移植到一个新的菜含有PBS。 </li><li>钳和昆虫引脚引脚的胚胎，并吸出PBS的。替换，与4％的PBS PFA，并让胚胎在室温下修复的上半年。 </li></ol>第2部分：准备胚胎抗体的一步<ol><li>为了尽量减少潜在的微生物污染，使用以下步骤DDH 2 O 。 </li><li>胚胎固定后，吸出固定液，并妥善处置化学废物。填写菜用PBS。 </li><li>下，使用显微切割刀，切一个胚胎周围的广场删除胚外膜。取出钳虫引脚。 </li><li>引脚已被删除后，使用钝年底巴斯德吸管胚胎转移到闪烁瓶中含有与PBT（PBS pH值7.4，0.5％TRITON X）。 </li><li>洗净与PBT的胚胎，3次，每次10分钟。 </li><li>从闪烁瓶中取出PBT和替换PBTx含有0.3％H 2 O 2，以灭活内源性过氧化物酶的潜在。 </li><li>孵育在室温下2小时就nutator。 </li><li> PBT，3次，每次10分钟，然后3次，每次30分钟洗净的胚胎。 </li></ol>第3部分：抗体孵育<ol><li>与抗体染色胚胎，阻止缓冲区或1％BSA / 1％农工商/ PBT（我们使用，因为二级抗体山羊提出的农工商超市）的胚胎洗一小时开始。一小时在室温下孵育nutator。 </li><li>稀释阻塞的缓冲区，并在这2天在4 °上nutator彗星的解决方案培育胚胎的主要抗体1:1。小学抗体稀释倍数取决于初级抗体的选择。在这里，我们使用的发育研究杂交瘤细胞上清提供的银行，这是一种抗体。我们在封闭液稀释为1:1。 </li><li>接下来，执行3 PBT 10分钟洗涤，其次是在PBT洗涤3 1小时。 </li><li>洗涤后，在封闭液稀释的二级抗体1:2500（过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（H + L），孵化的胚胎，并在此解决方案在这种情况下，O / N在4 °彗星上nutator。 </li><li>执行3 10分钟的洗涤，在PBT 3 1小时在PBT洗涤。 </li></ol>第3部分：显色反应<ol><li>要发展的显色反应的染色胚胎，第一次执行2 Tris缓冲液（100MM三盐酸，pH值7.4）20分钟的清洗。 </li><li>同时民建联基板（3,3&#39; - 二氨基tetrahydrochloride）溶解在Tris缓冲500μg/ml通风柜下，保持在黑暗的解决方案，在冰上。 </li><li>小瓶含胚胎取出最后的Tris缓冲液洗和步骤3.25毫升DAB溶液取代。在20分钟就nutator保持黑暗。处理的Eppendorf提示中含有10％的漂白粉溶液，以净化民建联桶。 </li><li>同时准备了0.3％的股票卫生署2 H 2 O 2在冰上。 </li><li>加入50μL股票H 2 O 2小瓶民建联胚胎。请在黑暗。 1-2分钟后，显示器在显微镜下的反应。 </li></ol>第4部分：摄影和组织学胚胎处理<ol><li>当显色反应完成后，民建联在处置漂白水桶。更换5毫升自来水。 </li><li>进行10分钟的PBS洗。 </li><li>要处理摄影和蜡切片，脱水乙醇（25％，50％，75％和100％），每次10分钟。 </li><li>更换乙醇与0.5 - 1毫升雪松木油（这会令胚胎半透明）。雪松木油的摄影过程​​。 </li><li>摄影后，返回胚胎样品瓶和雪松木油取代100％的乙醇。重复乙醇一步。 </li><li>更换Ëthanol 5％快绿FCF 100％的乙醇，孵育3分钟（这一步将会使胚胎组织学可见）。替换快绿FCF解决方案100％的乙醇和组织学过程。 </li></ol>代表性的成果： <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="图2" width="600" height="498" />在下面的例子所示，胚胎阶段的HH 10（A）12（B）和11（三）在解剖胚胎显示在新兴的神经crestas百富7的表达以及在体节和神经管（A，B）; （c）中，脊索的是标有15.3B9（不- 1）（发育研究杂交瘤细胞银行提供的抗体）。

<ol>
	<li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system:+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord.">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li><li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+HGF/SF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen's+node+during+gastrulation.">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li><li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7.">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li><li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen's+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li></ol>

本视频演示了年轻的鸡胚在执行整个安装抗体染色的不同步骤。这个协议基本上是用于小鸡 2,3表征的新型抗体的空间和时间，以及已知的抗原标志物的使用，以确定胚胎畸形，侮辱4。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eggs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>Premium Fertile</td>
<td>Fertilized, HH4 (16 hr)</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereomicroscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>MZ9.5 or similar</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Marsh Automatic Incubator</td>
<td>Other</td>
<td>Lyon</td>
<td>RX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps (1)</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72991-4C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps (2)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11002-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14161-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Plastic dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber Bulb</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur Capillary Pipette</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70950-12</td>
<td>round edge under flame</td>
</tr>
<tr>
<td>Microdissecting knife</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10056-12</td>
<td>Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>0001986475</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>16% PFA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% H2O2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>005-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibodies</td>
<td>Reagent</td>
<td>Developmental studies Hybridoma Bank</td>
<td>4G11, 15.3B9, PAX7</td>
<td>For these antibodies, investgators used mouse donnors</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3,3&#x2019;-diaminobenzidine tetrahydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>34001</td>
<td>Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cedar wood oil</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>W522503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>F7252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minuten pins 0.2mm diam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for whole mount antibody staining in chick

鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其研究在发育中的大脑，神经管和体节抗体表达的理想工具。本视频演示了在整个安装使用HRP标记二抗抗体染色的不同步骤，首先，从鸡蛋解剖胚胎和多聚甲醛固定。二，内源性过氧化物酶的灭活胚胎，然后暴露的主要抗体。经过多次洗涤，胚胎培养，以辣根过氧化物酶标记的第二抗体。过氧化物酶活性，发现用二氨基联苯胺底物的反应。最后，胚胎是固定的，摄影和切片处理。在使用荧光抗体这种方法的优点是可以处理的胚胎蜡切片，从而使截面抗原的网站研究。这种方法最初是由简多德和汤姆Jessell<sup&gt; 1</sup&gt;。

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

本视频演示了整个安装免疫组织化学，抗原的时空表达模式的方法是，可以在年轻的鸡胚可视。这种方法最初是由简多德和汤姆Jessell。

整装在鸡的抗体染色方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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