从成年小鼠肾脏中分离细胞核以进行单核RNA测序

我们的方法有助于在单细胞水平上生成和理解来自复杂组织的基因表达数据。我们的方法基本上可以以相同的方式应用于任何组织，并且只需很少的协议相关伪影即可获得高质量的数据。来自Schmidt-Ott实验室的Janna Leiz博士和我本人将介绍该协议。

首先将肾脏放在冷解剖板上，然后使用锋利的手术刀或剃须刀片获得一到两毫米的中间切片。确保组织片包含整个皮质髓质轴。使用显微解剖剪刀和镊子小心地从中心部分的侧面修剪皮层。

在解剖的组织片内，皮质、延髓外和髓质内三节应清晰可见。将肾脏碎片转移到先前制备的RNA稳定溶液中，并在4摄氏度下孵育24小时，以避免RNA降解。24小时后，取出RNA稳定溶液。

用薄纸小心地去除多余的溶液，并将纸巾存放在零下80摄氏度，直到进一步使用。取冷冻的肾脏片，并将其转移到含有一毫升细胞核裂解缓冲液 1 或 NLB1 的冰上的 60 毫米预冷聚苯乙烯培养皿中。使用剃须刀片或手术刀彻底切碎组织。

切下一毫升移液器吸头的尖端，并将切碎的组织和缓冲液转移到放置在冰上的研磨管中。确保所有碎片都已转移，用缓冲液洗涤培养皿5至10次。将研杵A在冰上的研磨管中缓慢上下移动25次，以使悬浮液均匀化。

将匀浆通过冰上预冷的 15 毫升收集管中的 100 微米过滤器，并用另一毫升 NLB1 清洗过滤器。用冷EZ细胞核裂解缓冲液清洗研磨管并丢弃缓冲液。将匀浆转移回研磨管中，并在冰上的研磨管中缓慢上下移动杵B15次，以使悬浮液均质化。

将匀浆转移到冰上预冷的15毫升收集管中。用另外两毫升NLB1清洗研磨管，并确保将所有组织碎片转移到收集管中。将匀浆在冰上孵育五分钟以裂解细胞。

将匀浆通过 40 微米过滤器进入预冷的 15 毫升收集管中。在带有水平吊篮转子的离心机中以 500 倍 G 和 4 摄氏度旋转收集管五分钟。同时，将RNase抑制剂溶液添加到NLB2中。

在不干扰沉淀的情况下除去上清液。小心地将沉淀重悬于四毫升NLB2中。小心地用一毫升蔗糖梯度缓冲液垫垫覆盖悬浮液。

在带有水平吊篮转子的离心机中以 500 倍 G 的速度在 4 摄氏度下旋转悬浮液 5 分钟。同时，将RNase抑制剂溶液加入细胞核悬浮缓冲液中。离心后，轻轻地从离心机中取出收集管，在处理收集管时注意不要干扰两层。

可以在两层之间观察到细胞碎片。小心地除去上清液，从碎片开始。在不干扰细胞核沉淀的情况下除去剩余的上清液，并小心地将沉淀重悬于一毫升细胞核悬浮缓冲液中。

将匀浆通过 20 微米过滤器进入预冷的 5 毫升荧光激活细胞分选收集管中。将基因的数量与由唯一分子标识符定义的转录本数量绘制图，并通过线粒体读数的分数着色，以评估分离的细胞核的质量。在6，000个细胞核中总共检测到20，000个基因，每个细胞核有1，600个中位数基因和2，800个中位数唯一分子标识符。

使用点图可视化簇富集标记的基因表达模式，并在t分布随机邻域嵌入图中可视化细胞类型簇。计算每种细胞类型的百分比并用于确定近端小管与厚升肢细胞的比例。始终在 4 摄氏度下工作并在试运行中确定最佳组织量以确保高质量悬浮液和最佳浓度至关重要。