通过集成活细胞监测，自动生产人类诱导多能干细胞衍生皮质神经元和多巴胺神经元

本研究的总体目标是展示如何实施自动化程序，将人类IPS细胞培养和区分为神经元血统，以及其自动成像。标准化的自动化程序允许低实验变异，同时确保高表型可重复性。此外，该系统可以适应新协议的开发。

演示程序将是约阿希姆·塔格尔和埃利桑格拉·布雷桑，我们实验室的博士后。在自动化系统的图形用户界面中，单击资源仪器进程视图并选择资源仪器流程。单击运行仪器进程并运行运行 HEPA 发动机和重新加载进程。

选择要加载的资源，打开门，将细胞培养板和一次性提示加载到适当的位置，如弹出图像所示。然后用70%乙醇净化门，然后关闭并运行净化过程。该系统将被紫外线辐射消毒30分钟。

要用培养基或分离试剂装载板，执行运行 HEPA 发动机罩步骤并打开液体处理站的门。使用 70%乙醇去污后，将储液罐放在甲板上指定位置并去盖。关闭液体处理站的门，然后运行 InitHepaHood 资源仪器过程，以关闭 HEPA 发动机罩。

若要执行自动区域性方法，请在图形用户界面的日历视图中单击"添加过程步骤"并选择要在实验中使用的单元格行。使用向导选择项目并标记要使用的批次。单击右对箭头并导航到向导的下一页，选择要执行的过程步骤。

在向导的最后一页中，安排实验并设置运行该方法所需的相应参数详细信息变量。然后单击"确定"。在用人类 IPS 细胞悬浮液加载 50 毫升管后，加载涂层培养板以接收货架上的细胞，并执行从管法中播种板的方法。要计算布莱特菲尔德成像细胞仪中的细胞数，请自动准备一个带细胞悬浮在甲板上的 384 井计数板，并使用机械臂将 384 井计数板从甲板转移到布莱特菲尔德成像细胞仪。

计数后，系统会将板返回其原始位置，并将涂层培养或检测板从搁板转移到移液台。然后，系统将在用户定义的编号和体积中播种适合板的细胞，然后通过移液混合。播种后，板将移动到甲板上摇床10秒，每分钟500转细胞分布，然后转移到二氧化碳培养箱。

要评估自动汇合，请执行检查汇合方法并选择至少包含一个培养板和没有检测板的批次。在参数详细信息部分中，iPSCf_2020图像分析设置中输入图像采集的参数。然后，系统将第一个板从培养箱转移到光明场成像细胞仪，并成像细胞汇合。

要改变细胞培养或检测板介质，执行培养板介质的介质变化方法，并选择只包含培养板的批次。系统会将板转移到甲板上，并倾斜板，以允许上一液的吸气。上流剂将被丢弃到废物收集模块中，并丢弃尖端，每个板将添加12毫升的新鲜介质。

然后，系统将重新盖上板，并将板返回到细胞培养箱。或者，为了改变检测板的介质，执行检测板的介质更换方法。要对细胞进行亚化，执行粘附细胞的子培养方法，并选择包含需要亚培养的培养板的批次。

丢弃介质后，系统将每板用 8 毫升 PBS 清洗细胞一次，然后向细胞中加入 8 毫升 0.5 毫升 EDTA。在甲板上使用倾斜选项 8 分钟后，EDTA 将更换为每板 12 毫升新鲜介质。该系统将每分钟以2000转的速度摇动细胞，一分钟来分离菌落，然后用五个循环的移液将细胞分离成50到80微米的团块。

然后，这些细胞将被转移到甲板上的50毫升管中，然后以一比七的分裂比播种。对于自动化的高含量、高通量细胞成像，执行成像方法并选择至少包含一个检测板和没有培养板的批次。然后，系统将检测板转移到自动共体显微镜进行成像。

在执行所需的过程步骤时，请确保选择正确的批次和板材 ID。应每天监测hiPSC培养物的生长情况，并分析其在光明场成像环测仪中的汇合百分比。在传传和手动或自动化系统培养后，细胞表现出典型的干细胞和多能标记表达。

在自动化培养系统中区分的神经元演示了与手动培养的神经元相似的形态和神经元网络组织。经过六天的分化后，自动分化皮质神经元对神经元特异性III类β-浴缸素和上皮质层标记表达呈阳性。八天后，细胞还表达微管相关蛋白2、神经细胞粘附分子、突触素一、皮质神经元标记。

在 hiPSC 中观察到这些标记的非常低或没有表达。该系统还可用于建立活细胞自动神经土菌生长测定，允许在11天的分化测量神经素长度，而无需人工干预。使用自动培养系统在65天的培养期内进行中等变化，有助于将hiPSC分化为中脑多巴胺神经元，具有预期的细胞组织和形态。

除了神经素生长外，还可以利用这种高通量、高含量的格式探索与研究神经退化相关的其他自动表型检测，例如，TDP-43易位RNA foci和α-核素纤维吸收。