Bu çalışmanın genel amacı, insan IPS hücrelerinin nöronal soylara dönüştürülmesi ve farklılaştırılması için otomatik prosedürlerin nasıl uygulanacağını ve bunların otomatik görüntülemesini göstermektir. Standartlaştırılmış otomatik prosedürler, yüksek henotypik tekrarlanabilirlik sağlarken düşük deneysel varyasyon sağlar. Buna ek olarak, sistem yeni protokollerin geliştirilmesi için uyarlanabilir.
Prosedürleri gösteren joachim Tager ve Elisangela Bressan, laboratuarımızdan post-docs olacaktır. Otomatik sistemin grafik kullanıcı arabiriminde, kaynak enstrüman ı işlem görünümünü tıklatın ve kaynak enstrümanı işlemini seçin. Çalıştır enstrüman işlemini tıklatın ve çalıştırılaç HEPA başlık ve yeniden yükleme işlemlerini çalıştırın.
Yüklenecek kaynakları seçin, kapıyı açın ve hücre kültür plakalarını ve tek kullanımlık ipuçlarını açılır görüntülerde belirtildiği gibi uygun konumlara yükleyin. Daha sonra kapanmadan önce kapıyı %70 etanol ile dezenfekte edin ve dekontaminasyon işlemini çalıştırın. Sistem 30 dakika boyunca UV radyasyonu ile sterilize edilecektir.
Plakaları kültür ortamı veya dissosiasyon reaktifi ile yüklemek için, run HEPA başlık adımını uygulayın ve sıvı taşıma istasyonunun kapısını açın. %70 etanol ile dekontaminasyondan sonra, rezervuarları güverteye atanan konuma yerleştirin ve kapağını kapatın. Sıvı işleme istasyonunun kapısını kapatın ve HEPA kaputunu kapatmak için InitHepaHood kaynak enstrümanı işlemini çalıştırın.
Otomatik bir kültür yöntemini yürütmek için, grafik kullanıcı arabiriminin takvim görünümünde, işlem adımı ekle'yi tıklatın ve denemede kullanılacak hücre satırını seçin. Projeyi seçmek ve kullanılacak toplu işlemi işaretlemek için sihirbazı kullanın. Sağdaki ok ucuna tıklayın ve yürütülecek işlem adımını seçmek için sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin.
Sihirbazın son sayfasında, denemeyi zamanlayın ve yöntemi çalıştırmak için gerekli uygun parametreleri ayrıntıları değişkenlerini ayarlayın. Ardından Tamam'ı tıklatın. 50 mililitrelik bir tüpü insan IPS hücre süspansiyonu ile yükledikten sonra, raftaki hücreleri almak için kaplamalı kültür plakaları yükleyin ve tüpler yönteminden plakaların tohumlama yürütmek. Brightfield görüntüleme sitometresindeki hücreleri saymak için, güvertede hücre süspansiyonu olan 384 kuyulu bir sayma plakası otomatik olarak hazırlayın ve 384 kuyudaki sayma plakasını güverteden Brightfield görüntüleme sitometresine aktarmak için robotik kolu kullanın.
Sayım dan sonra, sistem plakayı orijinal konumuna döndürecek ve kaplamalı bir kültür veya istinat plakasını raftan pipetleme güvertesine aktaracaktır. Sistem daha sonra hücreleri kullanıcı tarafından tanımlanan sayı ve hacimlerde plakaya uygun olarak tohumlayacak ve pipetleme ile karıştıracaktır. Tohumlamadan sonra, plaka karbondioksit kuvöze aktarılmadan önce hücre dağıtımı için dakikada 500 devirde 10 saniye boyunca güvertede çalkalayıcıya taşınır.
Otomatik birleşimi değerlendirmek için, denetim birleştirme yöntemini uygulayın ve en az bir kültür plakası ve hiçbir deneme plakası içeren bir toplu iş seçin. Parametreler ayrıntı bölümünde, görüntüleme analizi ayarlarına görüntü edinme için iPSCf_2020 girin. Sistem daha sonra ilk plakayı kuvözden Brightfield görüntüleme sitometresine aktaracak ve hücre birleşimini görüntüleyecek.
Hücre kültürünü veya test plakası ortamını değiştirmek için, kültür plakaları yönteminin ortam değişikliğini uygulayın ve yalnızca kültür plakaları içeren bir toplu iş seçin. Sistem plakaları güverteye aktaracak ve plakaları yatıracak ve süpernatantın aspirasyonuna izin verecek. Supernatant atık toplama modülüne atılır ve uçları atılır ve her plakaya 12 mililitre taze ortam eklenecektir.
Sistem daha sonra plakaları yeniden kapatacak ve plakaları hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürecek. Alternatif olarak, test plakalarının ortasını değiştirmek için, test plakaları yönteminin ortam değişimini gerçekleştirin. Hücreleri alt işlemek için, yapışık hücrelerin alt ekimi yöntemini uygulayın ve alt ekimi gereken kültür plakalarını içeren toplu işlemi seçin.
Orta attıktan sonra, sistem hücrelere 0.5 milimolar EDTA sekiz mililitre eklemeden önce plaka başına pbs sekiz mililitre ile bir kez hücreleri yıkayın. Eğilme seçeneği ile güvertede sekiz dakika sonra, EDTA plaka başına taze orta 12 mililitre ile değiştirilecektir. Sistem, kolonileri 50 ila 80 mikron kümelere ayırmak için beş döngü boruyla hücreleri üçe ayırmadan önce kolonileri yerinden çıkarmak için dakikada 2,000 devirde plakaları sallayacak.
Hücreler daha sonra bir-yedi bölünmüş oranda tohumlama önce güvertede 50 mililitrelik tüp aktarılacaktır. Otomatik yüksek içerik, yüksek iş grubu hücre görüntüleme için görüntüleme yöntemini uygulayın ve en az bir test plakası ve kültür plakası içermeyen bir toplu iş seçin. Sistem daha sonra görüntüleme için otomatik konfokal mikroskoba bir araştırma plakası aktaracaktır.
Gerekli işlem adımlarını gerçekleştirirken doğru toplu iş ve plaka adlarını seçtiğinizden emin olun. HiPSC kültürleri büyüme için günlük olarak izlenmeli ve Brightfield görüntüleme sitometresinde biraraya gelen yüzdeleri için analiz edilmelidir. Passaging ve manuel veya otomatik sistem kültürü sonra, hücreler tipik bir kök hücre ve pluripotency marker ekspresyonu sergiler.
Otomatik kültür sisteminde farklılaşan nöronlar, manuel olarak yetiştirilen nöronlara benzer morfoloji ve nöronal ağ organizasyonu gösterir. Altı günlük farklılaşmadan sonra, otomatik olarak diferansiye kortikal nöronlar nörona özgü sınıf III beta-tübulin ve üst kortikal tabaka belirteç ekspresyonu için pozitiftir. Sekiz gün sonra, hücreler de mikrotübül ilişkili protein ifade 2, nöral hücre adezyon molekülü, ve sinapsin I, yanı sıra kortikal nöron belirteçleri.
HiPSC'de bu belirteçlerin çok düşük veya hiç ekspresyonu gözlenmez. Bu sistem aynı zamanda manuel müdahale olmadan farklılaşma 11 gün boyunca ölçülebilir neurite uzunlukları sağlayan bir canlı hücre otomatik neurite outgrowth çıkış tsay kurmak için kullanılabilir. 65 günlük bir kültür döneminde orta değişiklikler gerçekleştirmek için otomatik kültür sisteminin kullanılması beklenen hücresel organizasyon ve morfoloji ile orta beyin dopaminerjik nöronlar içine hiPSC farklılaşmasını kolaylaştırır.
Nötrit çıkıntısına ek olarak, nörodejenerasyonu incelemek le ilgili diğer otomatik henotik tahliller, örneğin, TDP-43 translokasyon RNA foci ve alfa-sinüklein fibril alımı, bu yüksek iş üretimi, yüksek içerik biçimi kullanılarak incelenebilir.
