الهدف العام من هذه الدراسة هو إظهار كيفية تنفيذ الإجراءات الآلية لأصناف وتمايز خلايا IPS البشرية إلى أنساب الخلايا العصبية ، فضلا عن التصوير الآلي. تسمح الإجراءات الآلية الموحدة بانخفاض التباين التجريبي مع ضمان قابلية تكرار عالية للـphenotypic. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف النظام من أجل وضع بروتوكولات جديدة.
إثبات الإجراءات سيكون (يواكيم تاغر) و(إليسانجيلا بريسان) بعد المستندات من مختبرنا في واجهة المستخدم الرسومية للنظام الآلي، انقر فوق طريقة عرض عملية أداة الموارد وحدد عملية أداة المورد. انقر فوق تشغيل عملية الصك وتشغيل غطاء محرك السيارة هيبا تشغيل وإعادة تحميل العمليات.
حدد الموارد التي سيتم تحميلها، وفتح الباب وتحميل لوحات ثقافة الخلية والنصائح المتاح في المواضع المناسبة كما هو مبين من قبل الصور المنبثقة. ثم إزالة التلوث الباب مع 70٪ الإيثانول قبل إغلاق وتشغيل عملية إزالة التلوث. سيتم تعقيم النظام بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
لتحميل لوحات مع كاشف الثقافة المتوسطة أو فصل، تنفيذ الخطوة هيبا هود تشغيل وفتح باب محطة التعامل مع السائل. بعد إزالة التلوث مع 70٪ الإيثانول، ضع الخزانات على سطح السفينة إلى الموقع المخصص وإزالة غطاء لهم. إغلاق باب محطة معالجة السائل، ثم تشغيل عملية أداة الموارد InitHepaHood إلى السلطة أسفل غطاء محرك السيارة HEPA.
لتنفيذ أسلوب ثقافة تلقائي، في طريقة عرض التقويم لواجهة مستخدم الرسوم، انقر فوق إضافة خطوة عملية وحدد خط الخلية الذي سيتم استخدامه في التجربة. استخدم المعالج لتحديد المشروع ووضع علامة على المجموعة التي سيتم استخدامها. انقر فوق رأس السهم المواجه لليمين وانتقل إلى الصفحة التالية من المعالج لتحديد خطوة العملية التي سيتم تنفيذها.
في الصفحة الأخيرة من المعالج، قم بجدولة التجربة وتعيين متغيرات تفاصيل المعلمات المناسبة الضرورية لتشغيل الأسلوب. ثم انقر فوق موافق. بعد تحميل أنبوب 50 ملليلتر مع تعليق خلية IPS الإنسان، تحميل لوحات الثقافة المغلفة لاستقبال الخلايا على الرف وتنفيذ البذر من لوحات من طريقة أنابيب. لحساب الخلايا في جهاز قياس الخلايا التصوير برايتفيلد، قم بإعداد لوحة العد 384 بئرًا تلقائيًا مع تعليق الخلية على سطح السفينة واستخدام الذراع الروبوتية لنقل لوحة العد 384 من سطح السفينة إلى مقياس الخلايا التصويرية لـ Brightfield.
بعد العد، فإن النظام العودة لوحة إلى موقعها الأصلي ونقل ثقافة المغلفة أو لوحة المقايسة من الرف إلى سطح الأنابيب. ثم سيقوم النظام بذر الخلايا في عدد المعرفة من قبل المستخدم وأحجام مناسبة للوحة ومزيج عن طريق الأنابيب. وبعد البذر، سيتم نقل اللوحة إلى شاكر على سطح السفينة لمدة 10 ثوانٍ بمعدل 500 ثورة في الدقيقة لتوزيع الخلايا قبل نقلها إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
لتقييم الالتقاء الآلي، قم بتنفيذ طريقة التقاء الاختيار وحدد دفعة تحتوي على لوحة ثقافة واحدة على الأقل ولا لوحات فحص. في قسم تفاصيل المعلمات، أدخل iPSCf_2020 للحصول على الصور في إعدادات تحليل الصور. ثم سيقوم النظام بنقل اللوحة الأولى من الحاضنة إلى مقياس الخلايا التصويرية في Brightfield وصورة التقاء الخلية.
لتغيير ثقافة الخلية أو وسائط لوحة المعايرة، قم بتنفيذ طريقة تغيير الوسائط للوحات الثقافة وحدد دفعة تحتوي على لوحات بيانات ونُفذة فقط. سيقوم النظام بنقل اللوحات إلى سطح السفينة وإمالة اللوحات للسماح بطموح المابير. سيتم التخلص من المابير إلى وحدة جمع النفايات والتخلص من النصائح وسيتم إضافة 12 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل لوحة.
ثم سيقوم النظام بإعادة غطاء اللوحات وإعادة اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية. بدلا من ذلك، لتغيير المتوسطة من لوحات المقايسة، وتنفيذ تغيير وسائل الإعلام من طريقة لوحات فحص. إلى subcultivate الخلايا، تنفيذ subcultivation من الأسلوب الخلايا الضم وتحديد الدفعة التي تحتوي على لوحات الثقافة التي تحتاج subcultivation.
بعد التخلص من المتوسطة، سيقوم النظام بغسل الخلايا مرة واحدة بثمانية ملليلترات من PBS لكل لوحة قبل إضافة ثمانية ملليلترات من 0.5 ملليمولار EDTA إلى الخلايا. بعد ثماني دقائق على سطح السفينة مع خيار إمالة، سيتم استبدال EDTA مع 12 ملليلتر من المتوسطة الطازجة لكل لوحة. النظام سوف يهز لوحات في 2،000 الثورات في الدقيقة الواحدة لمدة دقيقة واحدة لطرد المستعمرات قبل triturating الخلايا مع خمس دورات من الأنابيب لتفريق المستعمرات إلى 50 إلى 80 ميكرون كتل.
ثم يتم نقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر على سطح السفينة قبل بذرها في نسبة تقسيم واحد إلى سبعة. بالنسبة لمحتوى عالي تلقائي، تصوير خلايا إنتاجية عالية، قم بتنفيذ طريقة التصوير وحدد دفعة تحتوي على لوحة فحص واحدة على الأقل ولا توجد لوحات بيانات استزراع. سيقوم النظام بعد ذلك بنقل لوحة فحص إلى المجهر confocal الآلي للتصوير.
تأكد من تحديد معرفات الدفعية والصفائح الصحيحة أثناء تنفيذ خطوات العملية المطلوبة. وينبغي رصد الثقافات hiPSC يوميا للنمو وتحليلها بالنسبة المئوية من التقاء في جهاز القياس التصويري برايتفيلد. بعد passaging وثقافة النظام اليدوي أو الآلي ، تظهر الخلايا تعبيرًا نموذجيًا لخلية جذعية وتعبير علامة متعددة القدرات.
تظهر الخلايا العصبية المتمايزة في نظام الثقافة الآلي تنظيمًا مماثلًا للتشكل والشبكة العصبية للخلايا العصبية المزروعة يدويًا. بعد ستة أيام من التمايز، الخلايا العصبية القشرية المتمايزة تلقائياً إيجابية للفئة الثالثة بيتا توبولين وعلامة الطبقة القشرية العليا. بعد ثمانية أيام، أعربت الخلايا أيضا عن البروتين المرتبط بالميككتوبول 2، وجزيء التصاق الخلية العصبية، والتشابك الأول، فضلا عن علامات الخلايا العصبية القشرية.
ويلاحظ انخفاض جدا أو أي تعبير عن هذه العلامات في hiPSC. ويمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لإنشاء خلية حية الآلي مقايسة نوريت التي تسمح أطوال neurite أن تقاس على مدى 11 يوما من التمايز دون تدخل يدوي. باستخدام نظام الثقافة الآلي لإجراء تغييرات متوسطة على مدى فترة ثقافة 65 يوما يسهل التمايز hiPSC في الخلايا العصبية الدوبامين منتصف البرية مع التنظيم الخلوي المتوقع ومورفولوجيا.
بالإضافة إلى نفيروث neurite، يمكن استكشاف غيرها من المقايسات الظاهرية الآلي ذات الصلة لدراسة تنكس الأعصاب، على سبيل المثال، TDP-43 نقل الحمض النووي الريبي foci و امتصاص ألفا سينوكلين فيبريل، باستخدام هذا الإنتاجية العالية، تنسيق المحتوى العالي.
