一种基于DNA/Ki67的流式细胞术测定法，用于接种疫苗的小鼠抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期分析

我们的方案提供了一种实用的方法，通过这种方法，小鼠脾脏和淋巴结可用于反映T细胞反应的动态，而不是提供稳态表型快照。我们的技术灵敏地检测参与持续反应的抗原特异性CD8 T细胞。测量增殖的CD8 T细胞，没有体内药物治疗或细胞转移的可能混杂效应。

我们的技术可以在多种环境中提供免疫动力学的窗口。例如，关于对疫苗接种和感染，自身免疫性疾病和癌症免疫治疗的反应。用蒸馏水稀释10倍透化缓冲液，准备新鲜的1x透化洗涤缓冲液，并通过0.45微米过滤器过滤以消除聚集体。

将单克隆抗体Ki67 FITC稀释在1x透化洗涤缓冲液中，通过滴定实验测定，每个样品的最终体积为100微升。向每个带有细胞的试管中加入3毫升1x透化洗涤缓冲液，并在室温下以400 G离心5分钟。丢弃上清液。

再次，加入1x透化洗涤缓冲液并离心以沉淀细胞。然后，丢弃上清液。向沉淀中加入100微升稀释的单克隆抗体Ki67 FITC，然后在黑暗中涡旋并孵育30分钟。

孵育后，用4毫升1x透化缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后离心，并弃去上清液。向细胞沉淀中加入350微升PBS，用于直接在流式细胞仪上获取样品，向细胞沉淀中加入250微升PBS，以便与Hoechst一起孵育用于DNA染色的样品。制备Hoechst和PBS溶液，并将其添加到每个样品中，使最终浓度为每毫升2微克。

在黑暗中涡旋并孵育样品15分钟。然后，离心样品五分钟，并向细胞沉淀中加入350微升PBS。打开软件，通过单击工作区功能区部分中的"创建组"，创建与要分析的不同器官对应的不同组。

通过双击组名称打开修改后的组窗口，并通过在同步函数上插入复选标记来同步新创建的组。将每个 FCS 文件拖动到其相应的组中，然后创建从 a-LN 组开始的门控策略。通过双击完全染色的样品打开图形窗口，以点图显示为样品获取的未测量事件。

请注意，x 轴和 y 轴在 FCS 文件中标注为，如本手稿流式细胞仪设置文件的表二所示。检查是否显示了足够数量的事件以进行适当的可视化。如有必要，通过单击工作区功能区中的心形图标打开首选项，选择"图形"，然后选择"点图"作为图形类型，并检查在相应框中绘制的点数是否正确或更改它。

在图形窗口中以点阵图显示未添加的事件，其中 DNA-A 在 x 轴上，DNA-W 在 y 轴上。对两个轴使用线性刻度。如有必要，通过单击图形窗口中靠近每个轴的T指示的框，将比例从对数更改为线性。

通过单击门控工具部分中的矩形来选择单个像元群，然后在矩形门的中心双击以点阵图显示单个像元，其中 FSC-A 参数位于 x 轴上，死区像片位于 y 轴上。单击多边形以选择活细胞群，这些活细胞群对于死细胞骰子为阴性。在多边形门的中心双击以点图显示像元，其中 FSC-A 参数位于 x 轴上，SSC-A 参数位于 y 轴上。

单击矩形并创建一个松弛的门，以包括该图中的所有单个活细胞。双击放松门的中心以点图显示点图中的单元格，其中 CD3 在 x 轴上，CD8 在 y 轴上。使用适当的访问比例在图形窗口中进行可视化。

如有必要，通过单击框（在每个轴附近用 T 表示）来修改 x 和 y 刻度，选择自定义访问功能，并根据需要使用基数和正十年修改额外的负十年。通过单击多边形选择CD3 + CD8 +单元格。双击 CD3+CD8+ 门的中心，以点阵图显示单元格，其中 Tetr-gag 位于 x 轴上，Pent-gag 位于 y 轴上。

通过单击多边形选择抗原特异性CD8 T细胞。双击特定嘎嘎声门的中心，以点阵图显示细胞，其中DNA-A在x轴上，Ki67在y轴上。通过单击图形窗口的门控工具部分中的Quad"来选择不同细胞周期阶段的单元格。

在一个样本中创建的门控策略复制到相应的组，以将门应用于该组的所有样本。然后复制b-脾和CBM组的门控策略，如文本手稿中所述。验证所有门都适合三组中的每个样本。

如有必要，请取消同步组并修改手稿中描述的门。在点图中显示松弛门的BM细胞，其中DNA-A在x轴上，Ki67在y轴上。通过单击工作区功能区部分中的"布局编辑器"来可视化结果。

将示例窗格中门控策略的每个门拖到布局编辑器中，并根据门控的顺序放置图。如有必要，请通过双击布局中的相应绘图并在图形定义窗口中选择适当的类型来更改图形类型。单击该组并按布局功能区上的函数进行迭代，以可视化从每个器官获得的抗原特异性CD8 T细胞中获得的结果，并比较不同的样品。

可视化代表阳性对照的骨髓细胞的结果。这里显示了骨髓细胞细胞周期分析的典型示例。该协议产生了G0至G1和G2至M DNA峰的低变异系数，表明DNA染色质量优异。

采用五步门控策略鉴定抗原特异性CD8细胞。使用两种多聚体来提高接种疫苗的小鼠中gag特异性CD8 T细胞检测的灵敏度，而不会增加未处理小鼠的染色背景。引流淋巴结和脾脏中的Gag特异性CD8 T细胞在增强后第三天含有S-G2 / M阶段的高比例细胞。

此外，S-G2 / M阶段的gag特异性CD8 T细胞在覆盖到来自同一器官的总CD8 T细胞上时具有高FSC-A和SSC-A。偏移直方图显示，除了淋巴结中G0中的少数细胞外，gag特异性CD8 T细胞的CD62L表达较低，正如激活的T细胞所预期的那样。该方法设计用于T细胞与膜和Ki67染色一起实现高质量的DNA染色。

流式细胞术数据分析是一个关键点。确保对浇口定位使用适当的控制。使用这种方法，我们在小鼠和人类外周血的细胞周期的S-G2 / M阶段发现了T细胞。

该技术可用于1型糖尿病、传染性单核细胞增多症和COVID-19的免疫监测研究。