Nosso protocolo fornece uma abordagem prática pela qual o baço do rato e os linfonodos podem ser usados para refletir a dinâmica da resposta celular T maior do que fornecer um instantâneo fenotípico de estado estável. Nossa técnica detecta sensivelmente células CD8 T específicas de antígeno que estão engajadas em uma resposta contínua. A proliferação de células CD8 T são medidas sem os efeitos possivelmente confusos do tratamento medicamentoso in vivo ou transferência celular.
Nossa técnica pode fornecer uma janela na dinâmica imunológica em várias configurações. Por exemplo, em relação à resposta à vacinação e infecções, doenças autoimunes e imunoterapia contra o câncer. Prepare o tampão de lavagem de permeabilização fresco de 1x diluindo 10x tampão de permeabilização com água destilada e filtre-o através de um filtro de 0,45 micrômetros para eliminar agregados.
Anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC em 1x tampão de lavagem de permeabilização como determinado com um experimento de titulação para um volume final de 100 microliters por amostra. Adicione 3 mililitros do tampão de lavagem de permeabilização de 1x em cada tubo com células e centrífuga a 400 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o supernatante.
Novamente, adicione o tampão de lavagem de 1x pormeabilização e a centrífuga para pelotar as células. Então, descarte o supernatante. Adicione 100 microliters de anticorpo monoclonal diluído Ki67 FITC à pelota, depois vórtice e incubar por 30 minutos no escuro.
Após a incubação, lave as células duas vezes com 4 mililitros de 1x tampão de permeabilização, percrifugando após cada lavagem e descarte o sobrenante. Adicione 350 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam adquiridas diretamente no citômetro de fluxo e 250 microliters de PBS à pelota celular para que as amostras sejam incubadas com Hoechst para coloração de DNA. Prepare a solução Hoechst e PBS e adicione-a a cada amostra para que a concentração final seja de dois microgramas por mililitro.
Vórtice e incubar as amostras por 15 minutos no escuro. Em seguida, centrifufique as amostras por cinco minutos e adicione 350 microliters de PBS à pelota celular. Abra o software e crie diferentes grupos correspondentes aos diferentes órgãos a serem analisados clicando em Criar Grupo", na seção fita do espaço de trabalho.
Abra a janela de grupo modificada clicando duas vezes no nome do grupo e sincronize os grupos recém-criados inserindo uma marca de verificação na função sincronizada. Arraste cada arquivo FCS para seu grupo correspondente e crie uma estratégia de gating começando com o grupo A-LN. Abra a janela de gráfico clicando duas vezes na amostra totalmente manchada para exibir os eventos não datados adquiridos para a amostra em um gráfico de pontos.
Observe que o eixo x e y são rotulados como nos arquivos FCS, conforme indicado na tabela dois do arquivo de configurações do citômetro de fluxo deste manuscrito. Verifique se um número suficiente de eventos é exibido para visualização adequada. Se necessário, abra as preferências clicando no ícone do coração na fita do espaço de trabalho, selecione Gráficos e, em seguida, Dot Plot" como tipo de gráfico e verifique se o número de pontos sorteados na caixa correspondente está correto ou altere-o.
Exibir os eventos untados na janela de gráfico em uma trama de pontos com DNA-A no eixo x e DNA-W no eixo y. Use escala linear para ambos os eixos. Se necessário, altere a escala de logarítmica para linear clicando na caixa indicada com um T próximo a cada eixo na janela de gráfico.
Selecione uma única população celular clicando em retângulo na seção de ferramenta gating e clique duas vezes no centro do portão retangular para exibir células únicas em um gráfico de pontos com parâmetro FSC-A no eixo x e célula morta morrer no eixo y. Clique no polígono para selecionar a população de células vivas, que são negativas para a morte de células mortas. Clique duas vezes no centro do portão do polígono para exibir as células em um gráfico de pontos com o parâmetro FSC-A no eixo x e o parâmetro SSC-A no eixo y.
Clique em retângulo e crie um portão relaxado para incluir todas as células vivas únicas nesse gráfico. Clique duas vezes no centro do portão relaxado para exibir as células em um gráfico de pontos com CD3 no eixo x e CD8 no eixo y. Use a escala de acesso apropriada para visualização na janela de gráfico.
Se necessário, modifique a escala x e y clicando na caixa, indicada com um T próximo a cada eixo, escolha Personalizar a Função de Acesso e modifique décadas extras com bases e décadas positivas conforme necessário. Selecione as células CD3+CD8+clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão CD3+CD8+para exibir as células em um gráfico de pontos com tetr-gag no eixo x e pent-gag no eixo y.
Selecione as células CD8 T específicas do antígeno clicando no polígono. Clique duas vezes no centro do portão específico da mordaça para exibir as células em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Selecione as células nas diferentes fases do ciclo celular clicando em Quad"na seção de ferramenta de gating da janela de gráfico.
Copie a estratégia de gating criada em uma amostra para o grupo correspondente para aplicar os portões a todas as amostras do grupo. Em seguida, copie estratégias de gating para os grupos b-baço e CBM, conforme descrito no manuscrito do texto. Verifique se todos os portões são apropriados para cada amostra dos três grupos.
Se necessário, dessincronize o grupo e modifique portões conforme descrito no manuscrito. Exibir as células BM do portão relaxado em um gráfico de pontos com DNA-A no eixo x e Ki67 no eixo y. Visualize os resultados clicando no Editor de layout"na seção fita do espaço de trabalho.
Arraste cada portão da estratégia de gating no painel de amostra para o editor de layout e coloque as parcelas de acordo com a sequência do gating. Se necessário, altere o tipo de gráfico clicando duas vezes no gráfico correspondente no layout e selecionando o tipo apropriado na janela de definição do gráfico. Clique no grupo e iterar por funções na fita de layout para visualizar os resultados obtidos em células CD8 T específicas de antígeno de cada órgão e comparar amostras diferentes.
Visualize resultados de células de medula óssea representando um controle positivo. Um exemplo típico de análise do ciclo celular das células da medula óssea é mostrado aqui. O protocolo rendeu um baixo coeficiente de variação de G0 para G1 e G2 para M picos de DNA, indicando excelente qualidade da coloração de DNA.
Uma estratégia de cinco passos foi empregada para identificar células CD8 específicas de antígeno. Dois multimers foram usados para melhorar a sensibilidade da detecção de células CD8 T específicas da mordaça em camundongos vacinados sem aumentar o fundo de coloração em camundongos não tratados. As células CD8 T específicas da mordaça nos linfonodos drenantes e no baço contêm uma alta proporção de células nas fases S-G2/M no terceiro dia após o impulso.
Além disso, as células CD8 T específicas da mordaça nas fases S-G2/M apresentaram FSC-A e SSC-A elevados quando sobrepostas às células CD8 T totais do mesmo órgão. Os histogramas offset mostraram que a expressão CD62L por células CD8 T específicas da mordaça era baixa, como esperado para células T ativadas, exceto por algumas células em G0 nos linfonodos. Este método foi projetado para células T para obter uma excelente qualidade de coloração de DNA juntamente com a membrana e a coloração ki67.
A análise de dados de citometria de fluxo é um ponto-chave. Certifique-se de usar o controle apropriado para posicionamento do portão. Usando este método, descobrimos células T em fases S-G2/M do ciclo celular em camundongos e sangue periférico humano.
Esta técnica foi útil em estudos de imunomonitoramento em diabetes tipo 1, mononucleose infecciosa e COVID-19.
