使用免疫荧光检测斑马鱼胚胎心脏PM_2.5诱发DNA损伤

这种方法可用于准确、轻松地检测斑马鱼心脏中目标蛋白的表达。目标蛋白的变化通过测量免疫荧光直接检测。执行斑马鱼胚胎收集和处理，如文本手稿中所述。

受精后72小时，将胚胎转移到玻璃滑梯上，并在立体显微镜下观察。记录心脏畸形，如腹膜水肿、循环改变和尺寸缩小。使用单向 ANOVA 计算畸形率并分析组之间的差异，然后是土耳其的多次比较测试。

在用每毫升MS222000克麻醉胚胎后，记录心跳30秒，并使用图像J软件量化心率。在立体显微镜下用一次性注射器针仔细剖析斑马鱼胚胎中的心脏。使用疏水屏障笔在干净的玻璃滑梯上画一个圆圈。

将50微升4%的甲醛加入PBS的1.25微升，形成固定溶液，然后将三颗解剖的心放入一个疏水屏障圈中，在室温下孵育20分钟。在显微镜下解除溶液，并在室温下干燥样品至少五分钟。每次洗涤三次 PBST 的幻灯片，每次洗涤五分钟。

将 50 微升 BSA 添加到 PBST 的 1000 微升中，以获得 5% 的 BSA 溶液，并将滑梯在潮湿的腔室中孵育一小时，以阻止非特定抗体结合。将溶液除以每次洗涤三次，每次用 PBS 清洗五分钟。在PBST的296微升中稀释两种小鼠单克隆抗体的微光素，对8-羟基二氧观氨酸和两种针对伽马-H2AX的兔子多克隆抗体微升，以获得有效的初级抗体鸡尾酒溶液。

在室温下或在四摄氏度的夜间，用50微升原抗体鸡尾酒溶液在潮湿的室内孵化心脏样本至少一小时。将溶液除以每洗五分钟，然后用 PBST 清洗样品三次。在PBST的500微升中稀释一个FITC标签山羊抗鼠二级抗体的微升和一个微升的psy-3山羊抗兔二级抗体，以获得有效的二级抗体鸡尾酒溶液。

在黑暗中室温下，用二次抗体孵育样品一小时。将溶液除以每次洗涤三次，每次用 PBS 清洗五分钟。在样品中加入20微升DAPI用于核染色，并在室温下孵育30分钟。

将盖片涂在滑梯上，用指甲油密封，以防止干燥和移动。在荧光显微镜下对样品进行成像，并使用 ImageJ 软件量化心脏区域的荧光信号。使用 DMSO 控制样本的平均值计算相关变化，并确定数据的统计意义。

在没有抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸或NAC的情况下暴露于PM2.5的胚胎，被评估为存在心脏畸形。与 DMSO 控制治疗的心脏相比，从 PM 2.5 开始的 EOM 成本显著增加心脏畸形，如心周水肿、改变循环和缩小大小。暴露于 EOM 的胚胎的心率也显著下降。

增加 NAC 衰减 EOM 诱发的心脏缺陷。免疫荧光检测用于评估 EOM 处理组织中的 DNA 损伤程度。用EOM治疗的斑马鱼胚胎的心脏中，8-羟基二氧观光素和伽马-H2AX表达水平显著增加，表明氧化DNA损伤和DNA双链断裂分别增加。

EOM 引起的 DNA 损伤部分抵消了 NAC 补充。在尝试此协议时，请小心用 PBS 清洗样品，因为斑马鱼心脏可能会从滑梯上剥落。