이 방법은 제브라피시 심장에서 표적 단백질의 발현을 정확하고 쉽게 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 표적 단백질의 변화는 면역 형광을 측정하여 직접 검출됩니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 제브라피시 배아 수집 및 치료를 수행합니다.
72 시간 후 수정, 유리 슬라이드에 배아를 전송하고 스테레오 현미경으로 관찰. 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 기형을 기록하십시오. 기형 비율을 계산하고 터키의 다중 비교 테스트 다음에 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
밀리리터 MS222당 0.6밀리그램으로 배아를 마취한 후 30초 동안 하트비트를 기록하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 심박수를 정량화합니다. 스테레오 현미경 의 밑에 일회용 주사기 바늘로 얼룩말 물고기 배아에서 조심스럽게 심혼을 해부합니다. 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 원을 그립니다.
PBS의 1.25 마이크로리터에 4%의 파라포름알데히드50마이크로리터를 추가한 다음, 해부된 3개의 하트를 하나의 소수성 장벽 원에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 용액을 데크로하고 적어도 5 분 동안 실온에서 샘플을 건조. PBST에서 슬라이드를 세 번 세척당 5분간 세척합니다.
50 마이크로리터의 BSA를 PBST 1, 000 마이크로리터에 추가하여 5%BSA 용액을 확보하고, 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 습한 챔버에서 슬라이드를 1시간 동안 배양한다. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 8-하이드록시데옥시구아노신에 대한 마우스 단일클론 항체 2개와 PBST의 296마이크로리터에서 감마-H2AX에 대한 토끼 폴리클론 항체 2개의 마이크로리터를 희석하여 1차 항체 칵테일 용액을 확보하였다.
심장 샘플을 1차 항체 칵테일 용액 50마이크로리터로 실내 온도에서 최소 1시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 가습된 챔버에 배양합니다. 용액을 데수제하고 세척당 5분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척합니다. FITC 표지염소 이차 항체 1개와 Psy-3 염소 항토끼 이차 항체 1개를 PBST 의 500 마이크로리터에 희석하여 이차 항체 칵테일 용액을 확보한다.
어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 이차 항체와 샘플을 배양. 액액을 데수수고 PBS로 시료를 세척당 5분간 3회 세척합니다. 핵 염색을 위해 샘플에 DAPI 20 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
슬라이드에 커버 슬립을 바르고 매니큐어로 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다. 형광 현미경의 밑에 견본을 심상하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심부지역의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 제어 샘플의 평균을 사용하여 상대적 변화를 계산하고 데이터의 통계적 유의여부를 결정합니다.
항산화제의 부재 또는 존재시 PM 2.5에 노출된 배아, N-아세틸-L-시스테인 또는 NAC는 심장 기형의 존재를 평가하였다. PM 2.5로부터EOM은 DMSO 대조군 처리 된 심장에 비해 심근 부종, 변경 된 반복 및 감소 된 크기와 같은 심장 성각 발생에 상당한 증가를 요합니다. 심박수는 또한 EOM에 드러난 태아에서 현저하게 감소했습니다.
NAC의 추가 감쇠 EOM 유도 심장 결함. 면역형광 분석은 EOM 처리된 조직에서 DNA 손상의 정도를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 8-하이드록시데옥시구아노신과 감마-H2AX 발현의 수준은 EOM으로 치료된 제브라피시 배아의 심장에서 크게 증가하여 각각 산화 DNA 손상과 DNA 이중 가닥 파손의 증가를 나타낸다.
EOM 유도 된 DNA 손상은 NAC 보충에 의해 부분적으로 중화되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때, 제브라피쉬 심장이 슬라이드를 벗겨 낼 수 있기 때문에 PBS로 샘플을 세척 할 때주의하십시오.
