Este método pode ser usado para detectar com precisão e facilidade a expressão de proteínas-alvo no coração de zebrafish. A mudança na proteína alvo é detectada diretamente pela medição da imunofluorescência. Realize a coleta e tratamento de embriões de zebrafish, conforme descrito no manuscrito do texto.
Às 72 horas após a fertilização, transfira os embriões para lâminas de vidro e observe-os sob um microscópio estéreo. Registra-lo malformações cardíacas, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho. Calcular taxas de malformação e analisar diferenças entre grupos usando uma forma ANOVA, seguido pelo teste de comparação múltipla da Turquia.
Depois de anestesiar os embriões com 0,6 miligramas por mililitro MS222, registos cardíacos por 30 segundos e quantificar as frequências cardíacas usando o software Image J. Dissecar cuidadosamente corações dos embriões de peixe zebra com uma agulha de seringa descartável sob um microscópio estéreo. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador de vidro limpo.
Adicione 50 microlitres de 4%de paraformaldeído a 1,25 microlitres de PBS para fazer uma solução fixa, em seguida, coloque três corações dissecados em um círculo de barreira hidrofóbica e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente. Decante a solução sob o microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Lave os slides três vezes em PBST por cinco minutos por lavagem.
Adicione 50 microliters de BSA a 1.000 microliters de PBST para obter uma solução BSA de 5% e incubar os slides em uma câmara úmida por uma hora para bloquear a ligação de anticorpos não específicos. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Diluir dois microliters de anticorpo monoclonal de camundongos contra 8 hidroxideoxyguanosine e dois microliters de anticorpo policlonal de coelho contra gama-H2AX em 296 microliters de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos primário funcionando.
Incubar as amostras cardíacas com 50 microliters da solução primária de coquetel de anticorpos em uma câmara umidificada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por cinco minutos por lavagem. Diluir um microliter de anticorpo secundário anti-rato de cabra com rótulo FITC e um microliter de anticorpo secundário anti-coelho psy-3 em 500 microliters de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos secundários em funcionamento.
Incubar as amostras com os anticorpos secundários por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem. Adicione 20 microliters de DAPI às amostras para coloração nuclear e incuba-os por 30 minutos à temperatura ambiente.
Aplique um deslizamento de tampa no slide e sele-o com esmalte para evitar a secagem e o movimento. Imagem as amostras sob um microscópio de fluorescência e quantificar o sinal fluorescente da área cardíaca usando o software ImageJ. Calcule as alterações relativas utilizando a média das amostras de controle do DMSO e determine a significância estatística dos dados.
Os embriões expostos à PM 2.5 na ausência ou presença do antioxidante, N-acetil-L-cisteína, ou NAC, foram avaliados para a presença de malformações cardíacas. O EOM da PM 2.5 custou um aumento significativo na teratogênese cardíaca, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho, em comparação com corações tratados com controle de DMSO. A frequência cardíaca também foi significativamente diminuída em embriões expostos ao EOM.
Adição de defeitos cardíacos induzidos pelo EOM no NAC. Um ensaio de imunofluorescência foi utilizado para avaliar a extensão dos danos de DNA nos tecidos tratados com EOM. Os níveis de 8-hidroxideoxyguanosina e expressão gama-H2AX foram significativamente aumentados nos corações dos embriões de zebrafish tratados com EOM, indicando um aumento nos danos oxidativos do DNA e quebras duplas de DNA, respectivamente.
O dano de DNA induzido pelo EOM foi parcialmente neutralizado pela suplementação do NAC. Ao tentar este protocolo, tome cuidado ao lavar as amostras com PBS, pois o coração de zebrafish pode descascar o slide.
