Этот метод может быть использован для точного и легкого обнаружения экспрессии целевых белков в сердце рыбок данио. Изменения в белке-мишени непосредственно обнаруживаются путем измерения иммунофлуоресценции. Выполняют сбор и обработку эмбрионов рыбок данио, как описано в тексте рукописи.
Через 72 часа после оплодотворения перенесите эмбрионы на стеклянные слайды и наблюдайте за ними под стереомикроскопом. Регистрировать пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер. Рассчитайте частоту пороков развития и проанализируйте различия между группами, используя один способ ANOVA, а затем многократный сравнительный тест Турции.
После обезболивания эмбрионов 0,6 миллиграмма на миллилитр MS222, записывайте сердцебиение в течение 30 секунд и количественно оцените частоту сердечных сокращений с помощью программного обеспечения Image J. Тщательно рассекните сердца от эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой шприцевой иглы под стереомикроскопом. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистом стеклянном слайде.
Добавьте 50 микролитров 4% параформальдегида к 1,25 микролитрам PBS, чтобы сделать фиксаторный раствор, затем поместите три рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Декантирует раствор под микроскопом и сушит образцы при комнатной температуре в течение не менее пяти минут. Мойте слайды три раза в ПБСТ в течение пяти минут за одну стирку.
Добавьте 50 микролитров BSA к 1000 микролитрам PBST для получения 5%-ного раствора BSA и инкубируйте слайды во влажной камере в течение одного часа, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение пяти минут за одну стирку. Развести два микролитра мышиного моноклонального антитела против 8-гидроксидезоксигуанозина и два микролитра кроличьего поликлонального антитела против гамма-H2AX в 296 микролитрах PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
Инкубируют образцы сердца с 50 микролитрами раствора коктейля первичного антитела в увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение пяти минут за одну стирку. Разбавьте один микролитр меченого FITC вторичного антитела против мыши против козы и один микролитр вторичного антитела против кролика psy-3 в 500 микролитрах PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител.
Инкубируют образцы с вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение пяти минут за одну стирку. Добавьте 20 микролитров DAPI в образцы для ядерного окрашивания и инкубировать их в течение 30 минут при комнатной температуре.
Нанесите на горку крышку и запечатайте ее лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Визуйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения, используя среднее значение контрольных выборок DMSO и определите статистическую значимость данных.
Эмбрионы, подвергшиеся воздействию PM 2,5 в отсутствие или присутствие антиоксиданта, N-ацетил-L-цистеина, или NAC, оценивали на наличие пороков сердца. EOM от PM 2.5 стоил значительного увеличения сердечного тератогенеза, такого как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер, по сравнению с сердцами, обработанными DMSO-контролем. Частота сердечных сокращений также была значительно снижена у эмбрионов, подвергшихся воздействию ЭОМ.
Добавление NAC ослабленных EOM-индуцированных пороков сердца. Иммунофлуоресцентный анализ был использован для оценки степени повреждения ДНК в тканях, обработанных EOM. Уровни экспрессии 8-гидроксидезоксигуанозина и гамма-H2AX были значительно увеличены в сердцах эмбрионов рыбок данио, получавших EOM, что указывает на увеличение окислительного повреждения ДНК и разрывов двух цепей ДНК соответственно.
Повреждение ДНК, вызванное ЭОМ, было частично противодействовано добавками NAC. При попытке этого протокола соблюдайте осторожность при мытье образцов PBS, потому что сердце рыбки данио может отслаиваться от слайда.
