我们的高吞吐量酵母细胞协议能够同时跟踪数千微殖子的生长和基因表达。在菌株之间、环境之间，甚至在共享环境中生长的基因相同细胞之间的差异可以量化。该协议精确估计了基因表达记者的平均增长率和平均荧光强度。
此外，由于对如此多的单个微殖子进行了分析，因此可以精确估计增长和表达值的整个分布。此协议遵循两个主要步骤，即实验板的准备和成像细胞的准备。在稀释和混合后，必须立即对细胞进行镀金。
因此，我们建议先设置您的实验板。您会注意到整个协议中细胞的反复混合，这在电镀之前的步骤中非常重要。在实验当天，所有用于检测的介质和其他解决方案都必须使用两微米滤镜进行过滤，即使它们已经不育，以便去除显微镜图像中可能出现的任何晶体。
这包括实验介质和康卡纳瓦林 A 解决方案。接下来，准备显微镜板。为了保持井的玻璃表面远离碎屑和划痕，请始终保持板下方的绒毛和静态自由擦拭。
在消毒的长凳上使用无菌技术。将 25 毫升 1X 康卡纳瓦林 A 溶液和 200 微升移液过滤到显微镜板的每口井中。我们建议稳定移液器，以确保适当的高度。
将显微镜板与绒毛和静态自由擦拭在它下面2分钟，在411倍G，以消除任何气泡，可以防止康卡纳瓦林A均匀地涂覆井底。让包含康卡纳瓦林 A 溶液的盘子休息一到两个小时。在实验中保持一致。
在康卡纳瓦林A孵化后，用吸力装置或用力将溶液从板中倒出，从而清除96井板中的康卡纳瓦林A。一些水滴将保留。接下来，通过在每口井中加入400微升无菌水来洗净水井。
取出康卡纳瓦林 A 溶液后立即加入水。不要让盘子坐干。重要的是避免用移液器尖触碰板的涂层底部，以免将康卡纳瓦林 A 从井的玻璃表面移走。
以与康卡纳瓦林 A 溶液相同的方式取出水，并立即在显微镜板中加入 185 微升实验介质。不要让盘子坐干。该板现已准备好添加50微升稀释细胞。
取回您预先生长的随机 96 井板。您的实验问题将确定细胞是否饱和或处于日志阶段，以及应在检测中使用的随机复制品数量。以 411 倍 G 将盘子离心两分钟，以最大限度地减少去除铝箔覆盖物时交叉污染的机会。
处理时一定要不要倾斜盘子。如果酵母和介质与覆盖板的铝箔接触，井间可能会有污染。首先准备盘子，你将进行你的连续稀释。
在稀释板中添加 90 微升实验介质。接下来准备你的细胞。从 96 井板中取出铝箔时要非常小心，以防止一口井的液滴进入另一口井。
由于离心，酵母将集中在盘子底部。为了确保细胞在稀释过程中混合良好，请始终在较大的介质中加入少量细胞。然后在混合物中添加另一大批介质。
确保每一步都大力混合移液器。在这段视频中，我们在饱和度和合成完整介质下对酵母细胞进行了稀释，我们将稀释1万倍，最终在显微镜板中达到每口井约4000个细胞的浓度。要重新悬浮细胞，移液器上下剧烈，并以圆形运动将移液器尖端移到井周围。
混合后，在任何井中都不应有安定酵母的痕迹，如在A1井中看到的。此处显示的所有其他油井均未重新暂停进行比较。例如，用血细胞计计算预生长板中的细胞，并与任何其他菌株结合，以相等的比例添加到同一油井中。在这里，我们将预生长板中的细胞与荧光参考菌株以一比一的比例混合在一起。
细胞浓度标准化后，在第一个序列稀释板中加入十微升细胞。然后将 100 微升介质添加到 200 微升的最后音量中。随着细胞和介质的加入，移液器大力混合，以圆形运动将移液器尖端移到井周围。
从此，直到细胞被添加到显微镜板中，快速通过协议进行。接下来，将第一个串行稀释板中的十微升酵母添加到第二个串行稀释板中。然后添加100微升的实验介质。
混合好。如果您的酵母没有絮凝的倾向，那么它们准备在此步骤后直接添加到显微镜板中。立即进行电镀。
但是，如果您使用的酵母菌株确实有适度的絮凝倾向，则需要以下可选的声波步骤。如果声波化，第一个移液器再次混合酵母溶液，在声波化之前。将稀释后的酵母放入声波器上，将 96 井销浸入每口井的溶液中，但不要接触井底。
设置声波程序，这是足够强大，以打破絮凝酵母细胞，但不会杀死细胞或导致压力反应升高。可能需要一些测试来确定给定实验的最佳声波程序。程序完成后，取出单元格并立即进入下一步。
将第二个连续稀释板中的 15 微升酵母加入显微镜板中。吹笛上下混合，但这样做要小心，以避免干扰连接在板井底部的康卡纳瓦林A。接下来，在显微镜板中加入200微升实验介质，最终体积为400微升。
派珀特谨慎地混合。用透气膜盖住盘子。确保板的边缘密封良好。
将显微镜板与绒毛和静态自由组织一起在它下面以411倍G进行两分钟，以便酵母细胞附着在板底部的康卡纳瓦林A上。该板现已准备就绪，可以进行成像。在显微镜下，用绒毛和静态自由擦拭擦拭板的顶部和底部，并将压缩空气吹到板的底部以清除碎屑。
将盘子放在显微镜上。确保 A1 井位于左上角，并将显微镜加热到正确的温度以促进细胞生长。还要确保盘子整齐地塞进显微镜中，板底是平的。
如果板有塑料盖，在开始显微镜之前将其取出。这对于捕获良好的图像以进行下游分析非常重要。我们加载一个自动生成的文件，带有 X 和 Y 坐标以及对焦位置，以映像整个显微镜板。
如果使用预生成的文件，请抽查显微镜板中的几个位置，以确保细胞处于正确的焦距平面。焦平面稍微高于细胞，以便它们被黑暗的边缘包围，并且它们比背景更亮，这很有帮助。设置用于实验的时间点数和时间点间距。
如果您同时收集生长速率和荧光强度数据，也设置荧光成像程序。调整每个通道的亮度以进行成像，以便显微镜板上的位置不会过度暴露。测试不在实时模式下时将使用的曝光。
对于荧光图像，肉眼应可见荧光。但除此之外，我们建议设置低曝光值。由单个细胞播种的适当间隔菌落沿着板块表面在单层中生长。
因此，可以使用自动图像分析来准确计算许多单个微殖民地的增长率。荧光标记可用于区分生长在同一油井中的多个菌株。因此，可以计算在共享环境中生长的个别微殖民地的增长率的整个分布。
这个实验可以实现的大样本量也允许精确估计不同菌株或生长条件之间的平均差异。在此，显示了从一组突变积累线和井内 GFP 参考控制菌落中生长在单井中的成对菌落的增长率。如果观察到细胞聚集在显微镜板上，则必须在电镀前通过声波分解团块。
未分解的团块中的细胞不会在板面的平面微殖中生长，因此不可能正确计算增长率。并非所有媒体都与微殖器增长率分析兼容。某些形式的介质，包括含有酵母提取物或具有低pH值的介质，防止细胞与康卡纳瓦林A结合。
重要的是要避免电镀细胞过于密集。当细胞被镀得太近时，生长较快的微殖子在较早的时间点合并，这里显示为颜色跟踪的丢失。这种影响可能会偏向增长率估计，因为生长缓慢的殖民地在收集足够时间点的数据之前不太可能与邻国合并。
根据生长条件，细胞的子集可能会在开始生长之前经历滞后阶段。在使用殖民地区域计算增长率时，必须考虑到这一点，而不是将增长曲线安装到所有可用的时间点。所述协议可用于调查与酵母生长和进化相关的各种问题。
其灵活的微板格式意味着它可以适应其他酵母物种，不同的生长条件，其他微生物，以及潜在的其他细胞培养。
