使用延时显微镜连续测量 大肠杆菌 中的生物噪声

本协议在草药中连续测量大肠杆菌的遗传电路，并计算单个细菌细胞中的信号变异性和信号噪声比，以评估电路性能。该技术的主要优点是，它易于适应不同的菌株和实验室，需要最少的培训，没有特殊设备，而且价格相对便宜。噪音在决定生物系统的功能方面起着重要作用。

目前，人们有兴趣建立大规模的基因电路。这些系统可以受到噪音的抑制，请务必将样品干燥好，尽可能长时间地将冷却垫保持在摄氏四度，并耐心而温和地切割和分割部件。为分析准备细菌，从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。

例如，与 GFP 记者的电路。在含有五毫升LB汤的玻璃管中，用相关抗生素补充。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时，直到汤多云。

在孵化结束时，在两毫升迷你离心机中旋转一毫升稀释溶液，并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到一个新的两毫升管中。然后，在将 40 到 60 微升悬浮剂播种到 M9 培养板上之前，先用摇晃将培养子孵育一小时。为了使细菌为分析做好准备，从受感染的大肠杆菌培养中接种单个菌落。

例如，一个装有GFP记者的电路在玻璃管中含有五毫升的LB汤，并辅以相关的抗生素。在摇晃的孵化器中以每分钟 37 摄氏度和 250 圈的速度生长细胞两个小时，直到汤多云。在孵化结束时，在两毫升迷你离心管中旋转一毫升稀释溶液，并将 30 微升细菌和整个稀释溶液体积转移到新的两毫升管中。

然后用震动孵育文化一小时。要准备显微镜板，将 112.5 毫克低熔化的 agar 与 40 毫克的 agar 混合，在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中混合 1 毫升 2% 的卡萨米诺酸。接下来，在 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶的内唇上加入 8.92 毫升的最小介质，并在短短两到三秒内微波处理由此产生的溶液。

然后将水浴温度设置为 55 摄氏度。当溶液清晰时，将 25 毫升 Erlenmeyer 烧瓶放在 60 摄氏度的水浴中，让 agar 溶液冷却，直到温度降至约 45 至 50 摄氏度。在阿加冷却时，用 70% 乙醇清洁实验室长凳，并将一块实验室胶带平滑到清洁的长凳上。

将一个玻璃盖滑到磁带上，并在附近放置第二个盖片。将冷却的阿加溶液添加到适当的抗生素和溶液中。将 1.5 毫升新鲜准备的凝胶溶液倒入放在胶带上的盖片上，并将第二个盖滑倒到凝胶上，小心避免气泡。

将 Erlenmeyer 返回热水浴池，盖住盖子 20 分钟。翻转盖片，在摄氏四度下孵化一小时。在孵化结束时，从干凝胶中取出盖片，从蔗糖中切下一个小垫子。

在孵化过程中，将制备细菌悬浮液中的六个微滑液滴加入 35 毫米的盘中，使滴子干燥至少 15 至 30 分钟。然后小心地将垫子一次放置在一滴细菌上，让样品在室温下放置20分钟。要放置 agar 床而不涂抹样品，请小心地将冷却垫放在液滴上，轻轻敲击。

要对样品进行成像，请从水中取出烧瓶，并让凝胶溶液冷却至体温。将三毫米的凝胶倒入样品板的外围。当糖体凝固后，用胶带密封板，并用25米针将几个孔插入胶带中。

然后将盘子倒置在摄氏4度，至少30分钟，使糖体完全凝固，同时防止细胞间质疏松。在 24 小时内，使用荧光共聚焦显微镜将样品定位在最低放大倍率，并采用显微镜的自动对焦系统。将油涂抹在适当的目标上，并使用平台控制器移动板，以小心地铺开油。

然后再次进行自动对焦，并按照 Z 步横截面的默认建议对示例进行映像。大肠杆菌应在白色背景上显示为黑色长方形。发光的动态范围应该显示其中心的峰值。

30分钟后，荧光显微镜可首先检测到线粒体事件。虽然单个细胞在低倍率下可能难以检测。以不正确的稀释比率制备的细菌细胞培养物可以证明细胞数量不变，而未密封板的样品可能表现出过度收缩，导致注意力丧失。

细胞还可以在寻找营养物质时吸收凝胶，导致细菌细胞相互叠叠，并损害细胞单层，有效防止细胞检测和可靠的荧光信号测量。根据这些数据的建议，分裂周期中的单元格阶段不影响噪声水平，因为不同区域范围表现出相同的趋势。此外，GFP 和超级倍频 GFP 之间的信号与噪声比率没有显著变化，这些代表性数据就说明了这一点。

执行此程序时，请注意确定用于实验的细菌菌株的正确稀释比。将每个受监管电路的信号噪声比与此基线进行比较，可以选择最佳性能电路，并揭示有趣的现象