Наш протокол для высокой пропускной способности дрожжевых клеток позволяет отслеживать рост и экспрессию генов для тысяч микроколоний одновременно. Разница между штаммами, между средами и даже между генетически идентичными клетками, выращенными в общей среде, может быть количественно оценена. Протокол дает точные оценки средних темпов роста и средней интенсивности флуоресценции экспрессии генов репортеров.
Кроме того, поскольку анализировано так много отдельных микроколоний, получены точные оценки всего распределения значений роста и выражения. Этот протокол следует за 2 главным образом шагами, подготовкой экспериментальной плиты и подготовкой клеток для изображения. Клетки должны быть поцалены сразу после разбавления и смешивания.
Поэтому мы рекомендуем сначала установить экспериментальную пластину. Вы заметите повторное смешивание ячеек на протяжении всего этого протокола, что крайне важно в шагах до покрытия. В день эксперимента все средства массовой информации и другие решения, используемые для анализа, должны быть отфильтрованы с помощью двух микрон-фильтров, даже если они уже стерильны, чтобы удалить любые кристаллы, которые могут появиться в микроскопических изображениях.
Это включает в себя экспериментальные средства массовой информации и решение Concanavalin A. Затем подготовь микроскопную пластину. Для того, чтобы держать стеклянную поверхность колодцев подальше от мусора и царапин, всегда держите ворсинок и статические свободной протрите под пластиной.
Используйте стерильную технику на стерилизованной скамейке. Фильтр 25 миллилитров раствора 1X Concanavalin A и пипетки 200 микролитров в каждую колодец микроскопной пластины. Мы рекомендуем стабилизировать пипетки, чтобы обеспечить правильную высоту.
Центрифуга микроскоп пластины с ворсинки и статические свободной протрите под ним в течение двух минут в 411 раз G для того, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые могли бы предотвратить Конканавалин от равномерного покрытия нижней части скважин. Пусть пластина, содержащая concanavalin раствор отдохнуть в течение одного-двух часов. Будьте последовательны в своих экспериментах.
После инкубации Конканавалина А очистить Конканавалин А от пластины 96 хорошо либо с всасывающим устройством, либо силой сбросив раствор из пластины, как показано здесь. Некоторые капли останутся. Затем промойте колодцы, добавив по 400 микролитров стерильной воды в каждую скважину.
Добавить воду сразу после удаления раствора Конканавалина А. Не позволяйте пластине сидеть сухой. Важно избегать прикосновения к покрытой нижней части пластины кончиками пипеток, чтобы не вытеснить или удалить Конканавалин А со стеклянной поверхности колодцев.
Удалите воду таким же образом, как раствор Concanavalin A и немедленно добавьте 185 микролитров экспериментальных средств массовой информации в микроскопную пластину. Не позволяйте пластине сидеть сухой. Пластина теперь готова к добавлению 50 микролитров разбавленных клеток.
Извлеките предварительно выращенную рандомизированную пластину из 96 колодец. Ваш экспериментальный вопрос будет определять, если клетки насыщены или в фазе журнала и количество рандомизированных репликаций, которые должны быть использованы в анализе. Центрифуга пластины в течение двух минут при 411 раз G, чтобы свести к минимуму вероятность перекрестного загрязнения при удалении фольги покрытия.
Будьте уверены, никогда не наклонять пластину, когда вы обрабатываете его. Если дрожжи и средства массовой информации вступают в контакт с фольгой, покрывающей пластину, может быть загрязнение через скважины. Сначала подготовите пластины вы будете проводить ваши серийные разбавления в.
Добавьте 90 микролитров экспериментальных средств массовой информации к каждой из ваших разбавленных пластин. Далее подготовь свои клетки. Будьте предельно осторожны при удалении фольги из 96-хорошо пластины, чтобы предотвратить капли из одного хорошо от входа в другой.
Дрожжи будут сосредоточены в нижней части пластины из-за центрифуги. Чтобы убедиться, что клетки хорошо смешиваются во время разбавления, всегда добавляйте небольшой объем клеток к большему объему мультимедиа. Затем добавьте еще один большой объем средств массовой информации в смесь.
Не забудьте пипетки смесь энергично на каждом шагу. В этом видео мы провели разбавления дрожжевых клеток при насыщении и синтетических полных медиа, которые мы разбавляем 10 000 раз, чтобы достичь конечной концентрации около 4000 клеток на колодец в микроскопной пластине. Чтобы вновь приостановить клетки, пипетка вверх и вниз энергично и переместить наконечник пипетки вокруг хорошо круговыми движениями.
После смешивания, не должно быть никаких следов поселились дрожжи, оставшиеся в любом хорошо, как видно здесь, в хорошо A1. Все остальные скважины, показанные здесь, не были повторно приостановлены для сравнения. Подсчитайте клетки в предварительно выращенной пластине, например, с гемоцитометром, и в сочетании с любым другим штаммом, который вы добавите к тому же хорошо в равных пропорциях. Здесь мы смешиваем клетки из нашей предварительно выращенной пластины с флуоресцентным эталонным штаммом при соотношении один к одному.
После того, как ваши концентрации клеток стандартизированы, добавьте десять микролитров клеток к первой серийной пластине разбавления. Затем добавьте 100 микролитров мультимедиа к окончательному объему 200 микролитров. С добавлением клеток и средств массовой информации, так, пипетка смесь энергично, перемещение пипетки кончик вокруг скважин круговыми движениями.
С этого момента, пока клетки не будут добавлены в микроскоп пластины, быстро пройти через протокол. Затем добавьте десять микролитров дрожжей из первой серийной пластины разбавления во вторую серийную пластину разбавления. Затем добавьте к этому 100 микролитров экспериментальных средств массовой информации.
Хорошо перемешать. Если ваши дрожжи не имеют тенденции к flocculate, то они готовы быть добавлены в микроскоп пластины сразу после этого шага. Немедленно приступайте к облицовке.
Однако, если штаммы дрожжей вы используете имеют умеренную тенденцию к flocculate, следующие дополнительные звуковой шаг будет необходимо. Если sonicating, первый пипетка смешать дрожжевой раствор еще раз, до sonication. Поместите разбавленные дрожжи на sonicator и погрузить 96-хорошо булавки в раствор каждой хорошо, но не касаясь нижней части хорошо.
Установите программу sonication, которая достаточно сильна для того чтобы сломать врозь flocculated клетки дрожжа, но не убивает клетки или не вызывает повышенные реакции усилия. Возможно, потребуется некоторое тестирование для определения наилучшей звуковой программы для данного эксперимента. Как только программа будет завершена, удалите ячейки и немедленно перейти к следующему шагу.
Добавьте в микроскоп 15 микролитров дрожжей из второй серийной пластины разбавления. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать, но сделать это осторожно, чтобы избежать тревожных Concanavalin прилагается к нижней части колодцев пластины. Затем добавьте 200 микролитров экспериментальных средств массовой информации к окончательному объему 400 микролитров к микроскопной пластине.
Пипетту перемешать осторожно. Обложка пластины с дышащий мембраны. Убедитесь, что края пластины хорошо запечатаны.
Центрифуга микроскопа пластины с ворсинки и статические свободной ткани под ним в течение двух минут в 411 раз G для того, чтобы дрожжевые клетки, чтобы прикрепить к Конканавалина в нижней части пластины. Пластина теперь готова к изображению. Под микроскопом протрите верхнюю и нижнюю часть пластины ворсиной и статической свободной салфеткой и удар сжатого воздуха на дно пластины, чтобы удалить мусор.
Поместите пластину на микроскоп. Убедитесь, что А1 хорошо находится в левом верхнем углу и что микроскоп нагревается до правильной температуры для роста клеток. Также убедитесь, что пластина аккуратно заправлена в микроскоп и что дно пластины плоское.
Если пластина имеет пластиковую крышку, удалите это перед началом микроскопии. Это будет важно для захвата хороших изображений для анализа вниз по течению. Мы загружаем автоматически генерируемый файл с координатами X и Y и координационными позициями для изображения всей микроскопной пластины.
При использовании предварительно сгенерированного файла, пятно проверить несколько позиций в микроскоп пластины для обеспечения клетки находятся в правильной фокусной плоскости. Это полезно для фокусной плоскости, чтобы быть немного выше клеток, так что они окружены темным ободом, и они ярче, чем фон. Установите количество точек времени и интервал между точками времени, которые вы будете использовать для эксперимента.
Если вы собираете данные о темпах роста и интенсивности флуоресценции, навеяте программу визуализации флуоресценции. Отрегулируйте яркость в каждом канале, чтобы быть изображены так, что нет позиции на микроскоп пластины переэкспонированных. Проверьте экспозицию, которую вы будете использовать, когда вы не находитесь в режиме живого времени.
Для флуоресцентных изображений флуоресценция должна быть видна невооруженным глазом. Но в противном случае мы рекомендуем установить низкие значения экспозиции. Соответствующие колонии, посеянные отдельными клетками, растут в монослойе вдоль поверхности пластины.
В результате, автоматизированный анализ изображений может быть использован для точного расчета темпов роста для многих отдельных микроколоний. Флуоресцентные маркеры могут быть использованы для дифференциации нескольких штаммов, растущих в той же хорошо. В результате можно рассчитать все распределения темпов роста для отдельных микроколоний, растущих в общей среде.
Большие размеры выборки, достижимые в ходе этого эксперимента, также позволяют точно оценить средние различия между различными штаммами или условиями роста. Здесь показаны темпы роста парных наборов колоний, выращенных в одиночных скважинах из набора линий накопления мутаций и в колодцах колоний управления ссылками GFP. Если клетки наблюдаются слипания на микроскоп пластины, сгустки должны быть разбиты sonication до покрытия.
Клетки в сгустках, которые не разбиты, не будут расти в планарной микроколонии вдоль поверхности пластины, что делает невозможным правильный расчет темпов роста. Не все средства массовой информации совместимы с анализом темпов роста микроколонии. Некоторые формы средств массовой информации, в том числе средства массовой информации, которые содержат экстракт дрожжей или имеет низкий рН, предотвратить связывание клеток конканавалина A.This приводит к клеткам, плавающим от растущих микроколоний в ходе эксперимента и ошибочные измерения темпов роста.
Важно, чтобы избежать покрытия клеток слишком плотно. Когда клетки помылись слишком близко, более быстро растущие микроколонии сливаются в более ранних точках времени, показанных здесь как потеря отслеживания цвета. Этот эффект может привести к смещениям оценок темпов роста, поскольку медленно растущие колонии с меньшей вероятностью сливаются со своими соседями до сбора данных из достаточного количества точек времени.
В зависимости от условий роста, подмножество клеток может пройти фазу отставания, прежде чем пристать к росту. Важно учитывать это при использовании колоний для расчета темпов роста, а не установки кривой роста на все доступные точки времени. Описанный протокол может быть использован для изучения широкого круга вопросов, связанных с ростом дрожжей и эволюцией.
Его гибкий формат микроплея означает, что он может быть адаптирован к другим видам дрожжей, различные условия роста, другие микробы, и потенциально другие клетки в культуре.
