הפרוטוקול שלנו לתפוקה גבוהה, תאי שמרים מאפשר מעקב אחר צמיחה וביטוי גנים לאלפי מיקרוקולוניות בו זמנית. ניתן לכמת את ההבדל בין זנים, בין סביבות ואפילו בין תאים זהים מבחינה גנטית הגדלים בסביבה משותפת. הפרוטוקול מניב הערכות מדויקות של קצב הצמיחה הממוצע ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של כתבי ביטוי גנים.
בנוסף, מכיוון שכל כך הרבה מיקרוקולונים בודדים הם מבחנים, מתקבלות הערכות מדויקות של התפלגויות שלמות של ערכי צמיחה וביטוי. פרוטוקול זה עוקב אחר שני שלבים עיקריים, הכנת צלחת הניסוי והכנת התאים להדמיה. התאים חייבים להיות מצופים מיד לאחר דילול וערבוב.
אז אנחנו ממליצים להגדיר את צלחת הניסוי שלך קודם. תבחין ערבוב חוזר ונשנה של תאים לאורך פרוטוקול זה, וזה חשוב מאוד בשלבים עד ציפוי. ביום הניסוי, יש לסנן את כל המדיה ופתרונות אחרים המשמשים לבדיקה באמצעות מסנן שני מיקרון, גם אם הם כבר סטריליים, על מנת להסיר כל גבישים שעשויים להופיע בתמונות מיקרוסקופ.
זה כולל מדיה ניסיונית ופתרון קונקאנאבלין A. לאחר מכן, הכינו את לוחית המיקרוסקופ. על מנת לשמור על משטח הזכוכית של הבארות נקי מפסולת ושריטות, תמיד לשמור על מוך סטטי לנגב חופשי מתחת לצלחת.
השתמש בטכניקה סטרילית על ספסל מעוקר. מסנן 25 מיליליטר של 1X Concanavalin פתרון פיפטה 200 מיקרוליטרים לתוך כל באר של צלחת מיקרוסקופ. אנו ממליצים לייצב את הפיפט כדי להבטיח גובה תקין.
צנטריפוגה צלחת מיקרוסקופ עם מוך סטטי לנגב חופשי מתחתיו במשך שתי דקות ב 411 פעמים G על מנת להסיר את כל בועות האוויר אשר יכול למנוע Concanavalin A מציפוי שווה את החלק התחתון של הבארות. תן את הצלחת המכילה את Concanavalin פתרון לנוח במשך שנה עד שעתיים. להיות עקבי על פני הניסויים שלך.
לאחר Concanavalin דגירה, לנקות את Concanavalin A מצלחת 96 גם עם מכשיר יניקה או על ידי השלכת הפתרון בכוח מתוך הצלחת כפי שמוצג כאן. חלק מהטיפות יישארו. לאחר מכן, לשטוף את הבארות על ידי הוספת 400 microliters של מים סטריליים לכל באר.
מוסיפים את המים מיד לאחר הסרת פתרון קונקאנאבלין A. אל תתנו לצלחת לשבת יבשה. חשוב להימנע מלגעת בתחתית המצופה של הצלחת עם טיפים פיפטה כדי לא לעקור או להסיר Concanavalin A מפני השטח זכוכית של בארות.
הסר את המים באותו אופן כמו פתרון Concanavalin A ומיד להוסיף 185 מיקרוליטרים של מדיה ניסיונית ללוח המיקרוסקופ שלך. אל תרשה לצלחת לשבת יבשה. הצלחת מוכנה כעת לתוספת של 50 מיקרוליטרים של תאים מדוללים.
אחזר את צלחת ה-96 באר האקראית שגודלה מראש. השאלה הניסיונית שלך תקבע אם התאים רוויים או בשלב יומן הרישום ואת מספר השכפולים האקראיים שיש להשתמש בהם בפקודה. צנטריפוגה הצלחת שלך במשך שתי דקות ב 411 פעמים G כדי למזער את הסיכוי של זיהום צולב בעת הסרת כיסוי נייר כסף.
הקפד לא להטות את הצלחת שלך כאשר אתה מטפל בו. אם שמרים ותקשורת באים במגע עם נייר כסף המכסה את הצלחת, יכול להיות זיהום על פני בארות. ראשית להכין את הצלחות תוכל לנהל את הדילולים הסדרתיים שלך לתוך.
הוסף 90 מיקרוליטרים של מדיה ניסיונית לכל אחד מלוחות הדילול שלך. לאחר מכן הכינו את התאים שלכם. היזהר מאוד בעת הסרת רדיד אלומיניום מצלחת 96-באר שלך כדי למנוע טיפות מבאר אחת מלהיכנס אחר.
השמרים יתרכזו בתחתית הצלחת עקב צנטריפוגה. כדי להבטיח שהתאים מעורבבים היטב במהלך הדילול, הוסף תמיד נפח תאים קטן לנפח מדיה גדול יותר. לאחר מכן הוסיפו כמות גדולה נוספת של מדיה לתערובת.
הקפד פיפט לערבב במרץ בכל צעד. בסרטון זה, ביצענו דילולים לתאי שמרים ברוויה ומדיה שלמה סינתטית, אשר אנחנו לדלל 10, 000 לקפל כדי להשיג ריכוז סופי של כ 4, 000 תאים לכל באר בצלחת מיקרוסקופ. כדי להשעות מחדש את התאים, פיפטה למעלה ולמטה במרץ ולהזיז את קצה פיפטה סביב הבאר בתנועה מעגלית.
לאחר ערבוב, לא צריך להיות עקבות של שמרים התיישבו שנותרו בכל טוב כפי שניתן לראות כאן גם A1. כל שאר הבארות המוצגות כאן לא הושעו מחדש לשם השוואה. לספור את התאים בצלחת הגדלה מראש שלך, למשל, עם hemocytometer, ולשלב עם כל זן אחר כי תוסיף לאותה באר בפרופורציות שוות. כאן, אנו מערבבים את התאים מהצלחת הגדלה מראש שלנו עם זן התייחסות פלואורסצנטי ביחס של אחד לאחד.
לאחר ריכוזי התאים שלך מתוקננים, להוסיף עשרה microliters של תאים ללוח הדילול הסדרתי הראשון. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיה לנפח סופי של 200 מיקרוליטרים. עם תוספת של תאים ומדיה כאחד, פיפטה לערבב במרץ, הזזת קצה פיפטה סביב בארות בתנועה מעגלית.
מנקודה זו ואילך, עד שהתאים מתווספים ללוח המיקרוסקופ, המשך במהירות דרך הפרוטוקול. לאחר מכן, מוסיפים עשרה מיקרוליטרים של שמרים מלוח הדילול הסדרתי הראשון לצלחת הדילול הסדרתית השנייה. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיה ניסיונית לזה.
מערבבים היטב. אם השמרים שלך אין נטייה flocculate, אז הם מוכנים להתווסף לצלחת מיקרוסקופ מיד לאחר שלב זה. המשך מיד לציפוי.
עם זאת, אם זני שמרים אתה משתמש יש נטייה מתונה flocculate, הצעד הבא sonication אופציונלי יהיה צורך. אם sonicating, פיפטה הראשונה לערבב את הפתרון שמרים שוב, לפני sonication. מניחים את השמרים המדוללים על sonicator להטביע את סיכות 96-באר לתוך הפתרון של כל באר, אבל לא נוגע בתחתית הבאר.
הגדר את תוכנית sonication, שהוא חזק מספיק כדי לפרק תאי שמרים flocculated, אבל לא הורג תאים או לגרום לתגובות מתח גבוהות. בדיקות מסוימות עשויות להידרש כדי לזהות את תוכנית sonication הטובה ביותר עבור ניסוי נתון. לאחר השלמת התוכנית, הסר את התאים והמשך מיד לשלב הבא.
מוסיפים 15 מיקרוליטרים של שמרים מלוח הדילול הסדרתי השני ללוח המיקרוסקופ. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, אבל לעשות זאת בזהירות כדי למנוע הפרעה Concanavalin A מחובר לתחתית בארות של הצלחת. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיה ניסיונית לנפח סופי של 400 מיקרוליטרים, ללוח המיקרוסקופ.
פיפט מתערבבת בזהירות. מכסים את הצלחת בקרום נושם. ודאו ששולי הצלחת אטומים היטב.
צנטריפוגה צלחת מיקרוסקופ עם מוך ורקמות סטטיות חינם מתחתיו במשך שתי דקות ב 411 פעמים G על מנת תאי שמרים לצרף את Concanavalin A בתחתית הצלחת. הצלחת מוכנה כעת לצילום. במיקרוסקופ, לנגב את החלק העליון ואת החלק התחתון של הצלחת עם מוך סטטי חופשי לנגב ולפוצץ אוויר דחוס על החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר פסולת.
מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ. ודא כי הבאר A1 נמצאת בפינה השמאלית העליונה וכי המיקרוסקופ מחומם לטמפרטורה הנכונה לצמיחת תאים. כמו כן, ודא כי הצלחת תחובה בצורה מסודרת לתוך המיקרוסקופ וכי החלק התחתון של הצלחת הוא שטוח.
אם הצלחת יש כיסוי פלסטיק, להסיר את זה לפני תחילת מיקרוסקופיה. זה יהיה חשוב כדי ללכוד תמונות טובות לניתוח במורד הזרם. אנו טוענים קובץ שנוצר באופן אוטומטי עם קואורדינטות X ו- Y ואת עמדות המוקד כדי לדמות את לוח המיקרוסקופ כולו.
אם אתם משתמשים בקובץ שנוצר מראש, בדקו כמה עמדות בלוח המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נמצאים במישור המוקד הנכון. זה מועיל עבור מישור המוקד להיות מעט מעל התאים, כך שהם מוקפים שפה כהה והם בהירים יותר מהרקע. הגדר את מספר נקודות הזמן ואת המרווח בין נקודות הזמן שבו תשתמש עבור הניסוי.
אם אתה אוסף הן נתוני קצב צמיחה והן נתוני עוצמת פלואורסצנטיות, הגדר גם תוכנית הדמיה פלואורסצנטית. כוונן את הבהירות בכל ערוץ כדי להדמית כך ששום מיקום בלוח המיקרוסקופ לא יתפרס. בדוק את החשיפה שבה תשתמש כאשר אינך במצב חי.
עבור תמונות פלואורסצנטיות, פלואורסצנטיות צריכה להיות גלויה לעין בלתי. אך אחרת אנו ממליצים להגדיר ערכי חשיפה נמוכים. מושבות במרווחים מתאימים הנזרעות על ידי תאים בודדים גדלות במונולייר לאורך פני השטח של הצלחת.
כתוצאה מכך, ניתן להשתמש בניתוח תמונה אוטומטי כדי לחשב במדויק את קצב הגדילה עבור מיקרוקולוניות בודדות רבות. סמנים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי להבדיל זנים מרובים הגדלים באותה באר. כתוצאה מכך, ניתן לחשב התפלגויות שלמות של שיעורי צמיחה עבור מיקרוקולונים בודדים הגדלים בסביבה משותפת.
גודל המדגם הגדול בר השגה בניסוי זה מאפשר גם הערכה מדויקת של ההבדלים הממוצעים בין זנים שונים או תנאי גדילה. כאן, שיעורי הצמיחה עבור קבוצות מזווגות של מושבות הגדלות בבארות בודדות מתוך קבוצה של קווי הצטברות מוטציה ומושבות בקרת התייחסות GFP היטב מוצגים. אם תאים נצפו גושים על צלחת מיקרוסקופ, גושים חייב להיות שבור על ידי sonication לפני ציפוי.
תאים בגושים שאינם מתפרקים לא יגדלו במיקרו-מושבה מישורית לאורך משטח הלוח, מה שהופך את החישוב הנכון של קצב הגדילה לבלתי אפשרי. לא כל המדיה תואמת לקצב הצמיחה של המיקרו-מושבה. צורות מסוימות של מדיה, כולל מדיה המכילה תמצית שמרים או יש pH נמוך, למנוע איגוד של תאים Concanavalin A.This תוצאות תאים צפים מן המיקרוקולוניות גדל במהלך הניסוי ומדידות קצב צמיחה שגוי.
חשוב להימנע ציפוי תאים בצפיפות רבה מדי. כאשר תאים מצופים מקרוב מדי, מיקרוקולוניות הגדלות מהר יותר מתמזגות בנקודות זמן מוקדמות יותר, המוצגות כאן כאובדן של מעקב אחר צבעים. השפעה זו יכולה להטות את הערכות קצב הצמיחה מכיוון שהמושבות הגדלות לאט נוטות פחות להתמזג עם שכנותיהן לפני איסוף נתונים מנקודות זמן מספיקות.
בהתאם לתנאי הצמיחה, קבוצת משנה של תאים עשויה לעבור שלב השהיה לפני תחילת הגידול. חשוב להסביר זאת בעת שימוש באזורי מושבה לחישוב קצב הצמיחה במקום להתאים עקומת צמיחה לכל נקודות הזמן הזמינות. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לחקור מגוון רחב של שאלות הקשורות לצמיחת שמרים ואבולוציה.
פורמט המיקרופלאט הגמיש שלו אומר שניתן להתאים אותו למינים אחרים של שמרים, תנאי גדילה שונים, מיקרואורגניזמים אחרים, ותאים אחרים בתרבות.
