该协议允许研究视网膜神经元的精细形态，并可以深入了解在疾病状态中发生的细胞和亚细胞形态变化。该方法显著提高了视网膜的光学透明度，并允许在激素视网膜制备中实现视网膜神经元的高分辨率、三维成像、电路布线和精细的亚细胞结构。用弯曲的钳子使鼠标眼睛受洗，并将它们转移到带有 0.1 M PBS 的小培养皿中。
在解剖显微镜下用针头沿着角膜硬膜结处戳一个小孔，然后将眼睛转移到4%功率甲醛中一小时。将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在科内奥斯特拉尔交界处一路切割。
取出角膜和镜片。然后在视神经底部切开它，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷，将其平整的 GCL 侧面放在三叶草状形状上，由硝基纤维素滤纸切成小方形。
用钳子拾起硝基纤维素纸的一角，放在48个油井板中，用4%的功率甲醛放置一小时，然后将滤纸和网膜转移到PBS的井中，每次洗三次，每次洗五分钟。在冰上解冻 A4P0 溶液。然后将小膜转移到A4P0溶液中，在四摄氏度的温度下温和地孵育一夜。
将植物油加入油井中，以完全覆盖 A4P0 溶液。在40摄氏度的水浴中孵化3小时，无颤抖。然后在 PBS 中洗三次，每次洗涤五分钟。
在40摄氏度的高温下将视网膜孵化两天，轻轻摇晃，然后用Triton X-100将滤纸和视网膜转移到PBS，每次洗涤90分钟洗5次。最后洗涤后，将视网膜存放在PBS-T的4摄氏度，含0.01%钠，或直接移动至免疫染色。用 PBS-T 中的细尖刷轻轻剥落滤纸，从滤纸中取出网膜。
在主抗体中孵育，在40摄氏度的阻塞溶液中稀释两天，轻轻摇晃。孵化后，在PBS-T中洗5次90分钟。在40摄氏度的阻塞溶液中用适当的二次抗体孵育视网膜，轻轻摇晃两天。
在整个过程的剩余过程中保护样品免受光线的照射。在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中洗涤 5 次，90 分钟。最后在40摄氏度的温度下，在基于山醇的折射指数匹配溶液中孵育网膜，轻轻摇晃。
勾勒出带有细尖永久标记的玻璃盖滑梯，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界。在一个角落留下一个小缺口，以便多余的安装解决方案以逃避。
将直膜转移到边界区域的中心，用细尖刷将其放置，使其与光感受器侧平放在玻璃滑梯上。派珀特约60微升的SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角。确保小膜保持平整和原位。
应用盖滑，从角落开始与 SRIMS，并慢慢降低它，直到它触及油脂的所有方面。将一叠三个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖滑，使山是平的，均匀的。
将幻灯片存放在摄氏四度，直到成像。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。要获取样品的 Z 堆叠图像，请首先单独聚焦每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。
通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后在中点周围指定范围，为 Z 堆栈设置范围。根据需要调整步幅大小或切片数量。捕获图像并保存原始文件。
然后作为 TIF 文件或其他所需的格式导出。使用图像分析、选择的软件来调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 Z 堆栈的三维渲染中实现最佳清晰度。与非加工控制视网膜相比，使用修改后的 CLARITY 协议处理时，观察到视网膜厚度的完全光学透明度。
此处显示了在 ONL 中标记的塞洛丁标记圆锥体的 Z 堆叠图像，在 INL 中标记 DAC 的 TH 的 Z 堆叠图像，以及在 GCL 中标记的 RBPMS 标记的 RGC 的 Z 堆叠图像。在叠加图像中观察到神经元在整个视网膜厚度的相对位置。TH染色和CLARITY处理整个视网膜山与从标准制备获得的图像进行比较。
与标准网状网膜相比，DAC 的树突和轴突状过程在清晰处理的网状中更清晰地显现出来。与标准的光膜相比，DAC 的Axon 样过程在清晰的网状网膜中表现出完整的环状结构。使用荧光显微镜拍摄的CLARITY光子的环状结构与使用共聚焦显微镜观察到的结构几乎相同。
类似轴龙的过程也向外视网膜运行。对GluA2和PSD-95的免疫染色显示明显的双关语，分别揭示含有AMPA受体和假设性后突触位点的单独GluA2。叠加图像显示了 DAC 进程上的一些点缀。
在 XZ、YZ 和 XY 平面中提出了假设性联合本地化点，TH 与 GluA2 和 PSD-95 都清晰地进行了联合本地化。重要的是，在水凝胶聚合过程中，网膜保持平整，以便清除的网膜可以平放用于安装和成像过程。
