Bu protokol, retinal nöronların ince morfolojisinin araştırılmasına izin verir ve hastalık durumlarında meydana gelen hücresel ve hücre altı morfolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Bu yöntem retinanın optik şeffaflığını önemli ölçüde artırır ve hormon retina hazırlanmasında retina nöronlarının yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntüleme, devre kablolama ve ince alt hücresel yapılarına izin verir. Fare gözlerini kavisli asalarla enükle edin ve 0,1 M PBS'li küçük bir Petri kabına aktarın.
Kornea sklera kavşağı boyunca küçük bir deliği diseksiyon mikroskobu altındaki iğne ile dürtün, ardından gözü bir saat boyunca% 4 güç formaldehitine aktarın. Gözü PBS'li bir tabağa geri aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, Korneoskleral kavşağın etrafını kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Korneayı ve lensi çıkarın. Daha sonra optik sinirin tabanında kesin ve retinayı izole etmek için sklerayı dikkatlice ön ayaklarla soyun. Retinanın etrafında eşit olarak dört küçük kesim yapın ve nitroselüloz filtre kağıdından kesilen küçük bir kare üzerinde yonca benzeri şekilde düz GCL tarafına koymak için PBS'ye batırılmış ince bir uç fırçası kullanın.
Nitroselüloz kağıdın köşesini forsepsle alın ve bir saat boyunca% 4 güç formaldehitli 48 kuyu plakasına yerleştirin, ardından filtre kağıdını ve retinayı PBS ile bir kuyuya aktarın ve her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Buz üzerinde A4P0 çözeltisi çözün. Daha sonra retinayı A4P0 çözeltisine aktarın ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.
A4P0 çözeltisini tamamen örtmek için kuyuya bitkisel yağ ekleyin. 40 santigrat derecede bir su banyosunda üç saat boyunca titreme olmadan kuluçkaya yaslanın. Daha sonra PBS'de üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın.
Retinayı iki gün boyunca 40 santigrat derecede % 10 Sodyum dodecyl sülfatta hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın, ardından filtre kağıdını ve retinayı Triton X-100 ile PBS'ye aktarın ve yıkama başına 90 dakika boyunca beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra retinayı PBS-T'de % 0.01 sodyum azit ile dört santigrat derecede saklayın veya doğrudan immün boyamaya geçin. Retinayı PBS-T'de ince bir uç fırçasıyla hafifçe soyarak filtre kağıdından çıkarın.
Birincil antikorda inkübe edilmiş, 40 santigrat derecede iki gün boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilir ve hafifçe sallandı. Kuluçkadan sonra PBS-T'de 90 dakika boyunca beş kez yıkayın. Retinayı, 40 santigrat derecede iki gün boyunca bloke çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla hafif titreme ile kuluçkaya yatırın.
İşlemin geri kalanı boyunca numuneleri ışıktan koruyun. Retinayı 0,02 M fosfat tamponunda 90 dakika boyunca beş kez yıkayın. Son olarak retinayı sorbitol bazlı kırılma indeksi eşleştirme çözeltisinde bir gecede 40 santigrat derecede hafif titreme ile kuluçkaya yatırın.
Cam mikroskop kaydırağının arkasında kare bir sınırı işaretlemek için ince uçlu kalıcı işaretleyicili bir cam kapak fişi anahattı. Slaydı ters çevirin ve slaydın önünde ince bir silikon gres çizgisi ile sınırı izlemek için bir şırınna kullanın. Fazla montaj çözeltisinin kaçması için bir köşede küçük bir boşluk bırakın.
Retinayı sınırlanan bölgenin ortasına aktarın ve ince bir uç fırçası ile cam kaydırağın yanında fotoreceptör tarafıyla düz olacak şekilde konumlandırın. Pipet yaklaşık 60 mikrolitre sRIMS, böylece düzleştirilmiş retinayı kaplar ve muhafazanın bir köşesine uzanır. Retinanın düz ve yerinde kaldığından emin olun.
SRIMS ile köşeden başlayarak kapak fişini uygulayın ve her taraftaki grese dokunana kadar yavaşça dirin. Monte retinanın her iki tarafına aralayıcı olarak üç kapak kayması yığını yerleştirin. Kapak fişini aşağı bastırmak için başka bir slaydın uzun kenarını kullanın, böylece Mount düz ve eşit olacak şekilde.
Görüntülemeye kadar slaytları dört santigrat derecede saklayın. Slaydı mikroskop aşamasına yerleştirerek ve numuneyi bularak başlayın. Örneklerin Z yığılmış görüntülerini elde etmek için, önce her kanaldaki sinyale ayrı ayrı odaklanın ve floresan veya konfokal mikroskoplar için pozlama süresini veya tarama hızını sırasıyla ayarlayın.
Odak düzlemini istediğiniz aralığın üst ve alt kısmına el ile ayarlayarak veya orta noktayı ayarlayıp orta noktanın etrafında bir aralık belirterek Z yığınının aralığını ayarlayın. Adım boyutunu veya dilim sayısını istediğiniz gibi ayarlayın. Görüntüyü yakalayın ve orijinal dosyayı kaydedin.
Daha sonra TIF dosyası veya başka bir istenen biçim olarak dışa aktarıldı. Hem tek görüntülerde hem de Z yığınının üç boyutlu işlenmesinde optimum netlik elde edilene kadar her kanaldaki parlaklığı ve kontrastı ayarlamak için tercih edilen yazılım olan görüntü analizini kullanın. Modifiye CLARITY protokolü ile işlendiğinde, işlenmemiş kontrol retinalarına kıyasla retinanın kalınlığı boyunca tam optik saydamlık gözlendi.
ONL'de Arrestin etiketli koniler için Z yığılmış görüntüler, INL'de DAC'ler etiketli TH ve GCL'de RBPMS işaretli RGC'ler burada gösterilmiştir. Kaplama görüntüsünde retinanın tüm kalınlığı boyunca nöronların göreceli konumu gözlendi. TH boyama ve CLARITY işlenmiş tüm Mount retinalar standart hazırlık elde edilen görüntülerle karşılaştırıldı.
DAC'lerin dendritleri ve akson benzeri süreçleri, netlik işlenmiş retinada standart bir retinaya göre daha net bir şekilde ortaya çıkmıştır. DAC'lerin Axon benzeri süreçleri, standart bir retinaya kıyasla netlik retinasında tam halka benzeri yapılar sergiledi. Floresan mikroskopi kullanılarak alınan CLARITY retinanın halka benzeri yapıları konfokal mikroskopi kullanılarak gözlenenlerle neredeyse aynıydı.
Akson benzeri işlemler de dış retinaya doğru akıp geçti. GluA2 ve PSD-95'e karşı immün boyama, sırasıyla AMPA reseptörleri ve putatif post sinaptik bölgeler içeren bireysel GluA2'yi ortaya çıkararak belirgin bir puncta gösterdi. Bir yer paylaşımı görüntüsü DAC işlemlerinde bazı puncta gösterdi.
Putatif birlikte yerelleştirme noktaları XZ, YZ ve XY düzlemlerinde sunuldu ve TH hem GluA2 hem de PSD-95 ile net bir şekilde birlikte yerleştirildi. Hidrojel polimerizasyon işlemi sırasında retinanın düz kalması önemlidir, böylece temizlenmiş retina montaj ve görüntüleme işlemi için düz bir şekilde uzanabilir.
