Этот протокол позволяет и исследование тонкой морфологии нейронов сетчатки и может дать представление о клеточных и субклеточных морфологических изменениях, которые происходят в болезненных состояниях. Этот метод значительно улучшает оптическую прозрачность сетчатки и позволяет проводить трехмерную визуализацию с высоким разрешением, проводку схем и тонкие субклеточные структуры нейронов сетчатки в гормональной подготовке сетчатки. Энуклеат глаз мыши изогнутыми щипцами и переведите их в небольшую чашку Петри с 0,1 М PBS.
Проделайте небольшое отверстие вдоль соединения склеры роговицы с иглой под рассеченным микроскопом, затем переведите глаз в формальдегид 4% мощности в течение одного часа. Перенесите глаз обратно к блюду с PBS. Под рассеченным микроскопом используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать весь путь вокруг корнеосклерального соединения.
Удалите роговицу и хрусталик. Затем отрежьте его у основания зрительного нерва и аккуратно отклейте склеру щипцами, чтобы изолировать сетчатку. Сделайте четыре небольших разреза равномерно вокруг сетчатки и используйте тонкую кисть, смоченную в PBS, чтобы положить ее плоской GCL стороной вниз в клеверной форме на небольшой квадратный срез из нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги.
Возьмите угол нитроцеллюлозной бумаги щипцами и поместите его в 48-ю пластину с 48-ти питательным формальдегидом на один час, затем переложите фильтровальную бумагу и сетчатку в колодец с PBS и промыть три раза в течение пяти минут каждый. Разморозить раствор А4П0 на льду. Затем переведите сетчатку в раствор А4П0 и высиживают в течение ночи при четырех градусах Цельсия с мягким перемешиванием.
Добавьте растительное масло в колодец, чтобы полностью покрыть раствор А4П0. Инкубировать на водяной бане при 40 градусах Цельсия в течение трех часов без встряхивания. Затем трижды мойте в PBS в течение пяти минут за одну стирку.
Инкубировать сетчатку в 10% додецилсульфате натрия при 40 градусах Цельсия в течение двух дней с легким встряхиванием, затем переложить фильтровальную бумагу и сетчатку на PBS с Triton X-100 и промыть пять раз в течение 90 минут за одну стирку. После окончательной промывки храните сетчатку при четырех градусах Цельсия в PBS-T с 0,01% азида натрия или переходите непосредственно к иммуноокраслениям. Удалите сетчатку с фильтровальной бумаги, аккуратно отклеив ее тонкой щеткой в PBS-T.
Инкубируют в первичном антителе, разведенном в блокирующем растворе в течение двух суток при 40 градусах Цельсия с легким встряхиванием. После инкубации промыть пять раз в течение 90 минут в PBS-T. Инкубируют сетчатку с соответствующими вторичными антителами, разведенными в блокирующем растворе в течение двух дней при 40 градусах Цельсия с легким встряхиванием.
Защитите образцы от света на протяжении всей оставшейся части процедуры. Промыть сетчатку пять раз в течение 90 минут в 0,02 М фосфатного буфера. Наконец, инкубируют сетчатку в растворе для согласования рефракционного показателя на основе сорбита при 40 градусах Цельсия в течение ночи с легким встряхиванием.
Очертите стеклянную крышку с помощью тонкого наконечника постоянного маркера, чтобы отметить квадратную границу на задней части слайда стеклянного микроскопа. Переверните слайд и с помощью шприца проследите границу тонкой линией силиконовой смазки на передней части слайда. Оставьте небольшой зазор в одном углу, чтобы лишний монтажный раствор вырвался.
Перенесите сетчатку в центр ограниченной области и расположите ее тонкой кончиком кисти так, чтобы она была плоской стороной фоторецептора на стеклянном слайде. Пипетка примерно 60 микролитров sRIMS так, чтобы она покрывала уплощенной сетчатку и простиралась до одного угла корпуса. Убедитесь, что сетчатка остается ровной и на месте.
Нанесите крышку, начиная с угла с помощью sRIMS, и медленно опустите ее, пока она не коснется смазки со всех сторон. Поместите стопку из трех слипов крышки с каждой стороны установленной сетчатки в качестве прокладки. Используйте длинный край другого слайда, чтобы нажать на скольжение крышки, чтобы крепление было плоским и ровным.
Храните слайды при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока не будет повыставка. Начните с размещения слайда на ступень микроскопа и найдите образец. Чтобы получить Z-сложенные изображения образцов, сначала сосредоточьтесь на сигнале в каждом канале индивидуально и установите время экспозиции или скорость сканирования для флуоресцентных или конфокальных микроскопов соответственно.
Установите диапазон для стека Z, вручную установив фокальную плоскость в верхней и нижней части требуемого диапазона, либо установив среднюю точку, а затем указав диапазон вокруг средней точки. Отрегулируйте размер шага или количество фрагментов по желанию. Запишите образ и сохраните исходный файл.
Затем экспортируется в виде файла TIF или другого требуемого формата. Используйте анализ изображений, программное обеспечение по выбору для настройки яркости и контрастности в каждом канале до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная четкость как отдельных изображений, так и трехмерного рендеринга стека Z. При обработке с модифицированным протоколом CLARITY наблюдалась полная оптическая прозрачность по всей толщине сетчатки по сравнению с необработанными контрольными сетчатками.
Здесь показаны Z-образы для конусов с маркировкой Arrestin в ONL, TH с метками DAC в INL и RGC с маркировкой RBPMS в GCL. Относительное расположение нейронов по всей толщине сетчатки наблюдалось на наложенном изображении. Окрашивание TH и CLARITY, обработанные всей сетчаткой Mount, сравнивали с изображениями, полученными при стандартной подготовке.
Дендриты и аксоноподобные процессы ЦАП были более четко выявлены в четко обработанной сетчатке, чем в стандартной сетчатке. Аксоноподобные процессы ЦАП демонстрировали полные кольцеподобные структуры в чистоте сетчатки по сравнению со стандартной сетчаткой. Кольцеподобные структуры сетчатки CLARITY, взятые с помощью флуоресцентной микроскопии, были почти идентичны тем, которые наблюдались с помощью конфокальной микроскопии.
Аксоноподобные отростки также шли к внешней сетчатке. Иммуноокрасивание против GluA2 и PSD-95 показало отчетливую пункту, выявляя отдельные GluA2, содержащие рецепторы AMPA и мтутивные постсинаптические участки, соответственно. На наложенном изображении показаны некоторые пункты на процессах DAC.
Точки предполагаемой совместной локализации были представлены в плоскостях XZ, YZ и XY, а TH четко локализован как с GluA2, так и с PSD-95. Важно, чтобы сетчатка оставалась плоской во время процесса полимеризации гидрогеля, чтобы очищенная сетчатка могла лежать плоско для процесса монтажа и визуализации.
