从人多能干细胞中定向诱导视网膜类器官

这是视网膜疾病的模型，模拟体内视网膜。在某种程度上，它可以取代动物实验。该方案针对视网膜类器官中感光器前体的质量和数量进行了优化，感光器是几种不可逆失明的关键。

首先在无饲养层条件下培养人类胚胎干细胞或hESC。为此，用一毫升每毫升试剂A的100微克涂覆六孔板的一个孔，并将板在37摄氏度下孵育至少半小时。解冻一百万hESC的等分试样，并以200xg离心五分钟。

除去上清液后，将细胞接种到先前包被的平板中，并在大约四天达到约80%汇合度后与两毫升试剂B.Passage一起将细胞接种。达到汇合后，用预热的DPBS洗涤细胞，并将其转移到500微升新鲜制备的试剂中。然后，将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育3.5分钟。

通过轻弹板的侧面和底部几秒钟来分离细胞，然后加入 500 微升准备好的培养基。将分离的细胞收获到新的1.5毫升管中，并上下移液细胞悬液。对于细胞计数，将 100 微升细胞悬液添加到 900 微升 DPBS 中。

在培养皿中用培养基稀释剩余的900微升细胞悬液，以达到每毫升10至第四个动力细胞的九倍。将 100 微升稀释的细胞悬液添加到非贴壁、V 形底、96 孔板的每个孔中。在低速摇床上轻轻旋转板五分钟，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育至第二天。

在第二天，向96孔板的每个孔中加入20微升1%试剂A，并在中心移液两次以分散死细胞。清洁板底部，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育直到第六天。在第六天，用60微升新鲜培养基替换58微升培养基，并继续孵育。

在第12天，从15毫升锥形管中的96孔板中收获细胞沉淀，并使沉淀在室温下自然沉降五分钟。当沉淀沉降时，在不干扰类器官的情况下除去上清液，并将细胞聚集体转移到含有18毫升培养基二的10厘米悬浮培养皿中，其中含有试剂A.将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育至第18天。在第18天，确认培养皿中产生半透明的光学囊泡，并使用显微手术刀切割生成的类器官。

将所有切好的颗粒聚集到盘子的中心。然后，将细胞收获到15毫升锥形猎鹰管中。当细胞沉降时，轻轻除去上清液，并将沉淀重悬于两个10厘米的培养皿中，用18毫升培养基，每个培养皿三个。

轻轻地将培养皿转移到培养箱中以避免细胞聚集。继续培养细胞，每周更换培养基。在第45天之后分析CRX表达式，直到第120天。

在这个代表性的分析中，显示了人类视网膜生成的各个阶段。在第六天，类器官在直径约为600微米的明亮边缘内以密集连接的集合体出现。在第12天，发生了视囊泡样结构的初始生成。

在第18天在培养皿中培养之前丢弃具有适当囊泡样结构的类器官。到培养的第30天，囊泡状结构更加明显，并且可以轻松区分和去除劣质RO。从第45天开始，类器官表达光感受器前体的各种标志物，如CRX，RCVRN和OTX2。

通过切割上视网膜类器官，分化效率显著提高，可以从96个平板中收获100多个高级类器官。