用利甘德分析（DRACALA）的微分径向毛细管作用识别小配体的结合蛋白

小信号分子瞄准各种效应蛋白，以控制细菌毒性和人类生物学。然而，这些效应蛋白是具有挑战性的识别。作为系统生物学工具，DRaCALA 允许使用 OVium 库对未知效应物蛋白进行可行、快速和高度敏感的识别。

DRACALA可用于研究任何小型信号分子，只要它可以标有放射性同位素或荧光染料。首先将大肠杆菌接种到1.5毫升的LB中，每米96井深井板中加入25微克氯霉素，在30摄氏度和每分钟160次旋转下进行隔夜孵育。第二天早上，在30摄氏度下用500微摩尔IPTG治疗通宵培养物6小时，以诱导蛋白质表达。

在孵化结束时，通过离心将细胞颗粒化，取出超高分子，并将样品冻结在零下80摄氏度。要启动裂解，在每口井150微升裂解缓冲器中重新使用颗粒，在零下80摄氏度下孵育30分钟，然后在37摄氏度下解冻细胞20分钟。然后，解酯应储存在零下80摄氏度，然后使用。

要完成过度表达蛋白质的细胞解析，将样品重新浸入40毫升冰冷裂解缓冲器2中，在2秒内以60%的振幅对样品进行声波处理，4秒后8分钟，然后通过离心清除裂解物。当样品被离心时，在站立的聚丙烯色谱柱中加入500微升同质镍-NTA树脂。15分钟后，用15毫升超纯水洗两次安定树脂，用15毫升裂解缓冲器洗两次。

在离心机结束时，将清除的解糖超高分子加载到柱子上。当所有的裂解液都流过柱子时，用30毫升的洗涤缓冲器清洗柱子。为了使蛋白质变质，在柱子上加入400微升的弹性缓冲液，并重复三次。

再用 300 微升体积的缓冲器重复三次，并将精化蛋白组合在 700 微升的最后体积中。对于精制样品的凝胶过滤，在用 25 毫升新鲜制备的凝胶过滤缓冲器清洗尺寸排除列后，使用 500 微升环将整个体积的 elt 蛋白加载到柱子上。以每分钟 500 微升的速度运行，收集两到三个 500 微升体积的相应蛋白质分数。

然后使用单个自旋柱浓缩每个蛋白质，并使用布拉德福德检测套件根据标准协议测量蛋白质浓度。合成标有瓜诺辛五磷酸盐的磷32，将小规模的Relseq反应组装在桌子上勾勒出的螺丝盖管中，在37摄氏度的热混合器中孵育反应一小时，在95摄氏度下孵化5分钟，然后在冰上孵化5分钟。在孵化结束时，通过离心将沉淀蛋白旋转下来，并将含有超高磷酸盐的合成磷32标记为瓜诺辛五磷酸盐转移到一个新的螺丝盖管中。

对于磷32瓜诺辛四磷酸盐合成，加入一个微摩尔GppA到磷32标签的五磷酸盐产品的一半在新的螺丝盖管和孵育反应10分钟在37摄氏度，5分钟在95摄氏度，5分钟在冰上。在孵化结束时，通过离心将沉淀物旋转，并将标有瓜诺辛四磷酸盐的磷32标记到一个新的管子中。要分析分离的目标蛋白，使用 1.5 摩尔单磷酸盐作为移动相，在薄层色谱板上运行每个样品的一微升。

分析后，将干燥板放入透明塑料文件夹中，将板暴露在存储磷屏上五分钟，然后可视化和量化磷成像仪上的数据。对于目标蛋白质的 DRaCALA 筛选，在 95 井 V 底微蒂板的个别井中加入 20 微升解冻批发裂解剂，并在每口油井中加入 2.5 单位的塞拉蒂亚马塞森内脏。在37摄氏度下15分钟后，将解冻剂放在冰上20分钟。

接下来，混合等量的磷32标记的瓜诺辛五磷酸盐和瓜诺辛四磷酸盐，并添加1X裂解缓冲器一到混合物，以获得四纳米摩尔瓜诺辛五磷酸盐溶液。使用多通道移液器和过滤移液器尖端，将瓜诺辛五磷酸盐混合物的10微升与细胞裂解液混合，在室温下孵育5分钟。在孵化结束时，在 0.01% 的非离子洗涤剂溶液中清洗 96X 针脚工具三次，然后每次洗涤在纸巾上干燥 30 秒，然后将针脚工具放入 96 井样品板中。

30 秒后，将销工具直接抬起，将其直接放在硝基纤维素膜上 30 秒。干燥五分钟后，将硝基纤维素膜放入透明塑料文件夹中，以便通过磷成像进行存储磷屏暴露和可视化。要量化和识别潜在的目标蛋白，在与磷成像仪相关的分析软件中，打开可视化板的凝胶文件。

要定义要分析的点，请使用阵列分析功能设置 12 列乘 8 行网格。要限制孔点的外缘，定义大圆，将定义的大圆的体积加背景和面积导出到电子表格中。要限制小内点，缩小定义的圆圈，导出定义的小圆的体积加背景和区域，并保存电子表格中的所有数据。

位置圆圈在必要时与点重叠，调整比实际点稍大的大小。使用方程计算电子表格中的绑定分数并绘制数据图。然后识别与其他大多数油井相比，油井中具有高结合分数的潜在结合蛋白。

在此具有代表性的分析中，可以观察到大多数油井中背景绑定信号相对较低的板。由于瓜诺辛五磷酸盐结合蛋白Hpt的过度表达，H3井中的正结合信号表现出的结合分数远远高于其他油井的结合分数。在代表性板块中，几口井显示出相对较高的背景结合信号，如许多油井中观察到的相对强的内点，以及量化后观察到的一贯高结合分数。

值得注意的是，一些目标还给出了可变的绑定分数，例如误报。为了进一步澄清，研究人员使用纯化蛋白再次测试结合。一旦目标蛋白质被识别出来，人们就可以用 DRACALA 、同温热度或其他方法将它们纯化为同质性，并确认相互作用强度和特异性。

识别小信号分子的目标蛋白质为深入了解细菌毒性对人类生物学的作用铺平了道路。