작은 신호 분자는 세균성 독성 및 인간 생물학을 통제하기 위하여 각종 이펙터 단백질을 표적으로 합니다. 그러나, 이 효력제 단백질은 확인하기 어렵습니다. 시스템 생물학 도구로서 DRaCALA는 OVium 라이브러리를 사용하여 알 수 없는 이펙터 단백질을 실현 가능하고 빠르며 매우 민감한 식별할 수 있습니다.
DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광염으로 표시될 수 있는 한 작은 신호 분자를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. E.coli를 LB의 1.5 밀리리터로 접종하여 96°C의 각 웰에서 밀리리터 클로람페니콜당 25마이크로그램으로 보충하여 1박 배양시 30도, 분당 160회 회전합니다. 다음날 아침, 단백질 발현을 유도하기 위해 섭씨 30도에서 6시간 동안 500 마이크로몰라 IPTG로 야간 배양을 치료한다.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿, 상체를 제거하고, 영하 80도에서 샘플을 동결. 용해를 시작하려면, 37섭씨에서 20분 동안 세포를 해동하기 전에 30분 간 영하 80도에서 30분 간 잠복하는 동안 잘 150마이크로리터의 용해 완충제에서 펠릿을 다시 분리한다. 그런 다음 lysate를 사용하기 전에 영하 80도에 보관해야합니다.
과발현 된 단백질로 세포의 용액을 완료하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 2의 40 밀리리터에서 샘플을 다시 중단하고 8 분 동안 4 초 에 60 %진폭에서 샘플을 초음파 처리 한 다음 원심 분리에 의해 lysates를 취소합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 상질화된 니켈-NTA 수지 500마이크로리터를 서있는 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼에 추가합니다. 15분 후, 정착수지15밀리리터의 초순수로 2회, 1회 15밀리리터의 리시스 버퍼 2로 세척합니다.
원심 분리가 끝나면 클리어된 리자테 상체를 열에 로드합니다. 모든 lysate가 컬럼을 통해 흐르는 경우, 세척 버퍼의 30 밀리리터로 열을 세척. 단백질을 용인하기 위해, 열에 용출 버퍼의 400 마이크로 리터 볼륨을 추가하고 세 번 용출을 반복합니다.
용출 버퍼의 또 다른 300 마이크로 리터 부피는 용출을 세 번 반복하고 700 마이크로 리터의 최종 부피로 용출 단백질을 결합합니다. 용출된 시료의 겔 여과를 위해, 갓 준비된 젤 여과 버퍼25밀리리터로 크기 배제 컬럼을 세척한 후, 500 마이크로리터 루프를 사용하여 용출된 단백질의 전체 부피를 컬럼에 적재한다. 분당 500 마이크로리터로 실행하고 각 단백질의 2~3개의 500마이크로리터 부피 분획을 수집합니다.
그런 다음 개별 스핀 컬럼을 사용하여 각 단백질을 농축하고 브래드포드 분석 키트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 구아노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)라고 표시된 인(32)을 합성하기 위해 테이블에 설명된 대로 나사 로크 튜브에 작은 규모의 Relseq 반응을 조립하고 온도 섭씨 37도에서 1시간, 섭씨 95도에서 5분 동안 ThermoMixer에서 반응을 배양하고 얼음에서 5분 간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전된 단백질을 스핀다운하고 새로운 나사 캡이 덮인 튜브에 초신을 함유하는 구노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)로 표기된 합성인(32)을 전달한다.
인 32 과노신 테트라포산염 합성의 경우, 새로운 나사 로크 튜브에 인 32 라벨과노신 펜타포스페이트 제품의 절반에 마이크로몰라 GppA 를 추가하고 10 분 동안 반응을 배양 37 섭씨, 섭씨 95도에서 5 분, 얼음에 5 분. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전을 회전하고 새로운 튜브에 상류체를 포함하는 구아노신 테트라포산염을 포함하는 인 32 를 전송한다. 격리된 표적 단백질을 분석하려면, 1.5개의 어금반 모노포타슘 인산염을 이동상으로 사용하여 얇은 층 크로마토그래피 플레이트에 각 샘플의 마이크로리터 1개를 실행한다.
분석 후, 말린 플레이트를 투명 플라스틱 폴더에 놓고 피광기 이미저에서 데이터를 시각화하고 정량화하기 전에 5 분 동안 저장 인광판 화면에 플레이트를 노출합니다. 표적 단백질의 DRaCALA 스크리닝의 경우, 해동 된 도매 용액 20 마이크로 리터를 95 웰 V-바닥 마이크로티터 플레이트의 개별 우물에 추가하고 각 우물에 세라티아 마르세센 엔토너리스 2.5 단위를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 20분 동안 얼음 위에 용사를 놓습니다.
다음으로, 동일한 부피 32개의 구아노신 펜타포산염과 구노신 테트라포산염을 혼합하고 혼합물에 1X 리시스 버퍼 1개를 추가하여 4나노몰라 관타나모 펜타포스페이트 용액을 획득한다. 다중 채널 파이펫과 여과된 파이펫 팁을 사용하여 구아노신 펜타포스페이트 혼합물의 10마이크로리터를 실온에서 5분간 잠복할 수 있는 셀 리자이트와 혼합합니다. 인큐베이션이 끝나면 96X 핀 공구를 30초 동안 논이온 세제용 0.01%의 용액으로 3회 세척한 후, 96웰 샘플 플레이트에 핀 툴을 넣기 전에 세척당 종이 타월에서 30초 건조를 합니다.
30초 후 핀 도구를 똑바로 들어 올려 니트로셀룰로오스 멤브레인에 30초 동안 똑바로 놓습니다. 건조 5분 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 투명 플라스틱 폴더에 배치하여 인광화상 영상에 의한 저장 형광식 스크린 노출 및 시각화를 입증하였다. 잠재적인 표적 단백질을 정량화하고 식별하려면 인광선 과 관련된 분석 소프트웨어에서 시각화 된 플레이트의 젤 파일을 엽니 다.
분석할 스팟을 정의하려면 배열 분석 함수를 사용하여 12열을 8열 그리드로 설정합니다. 구멍 반점의 바깥쪽 가장자리를 돌례하려면 큰 원을 정의하고 정의된 큰 원의 볼륨과 배경 과 영역을 스프레드시트에 내보냅니다. 작은 내부 점을 할당하려면 정의된 원 아래로 크기를 조정하고 정의 된 작은 원의 볼륨과 배경 및 영역을 내보내고 스프레드 시트에 있는 모든 데이터를 저장합니다.
필요에 따라 스팟과 겹치는 위치 원이 실제 반점보다 약간 큰 크기를 조정합니다. 방정식을 사용하여 스프레드시트의 바인딩 분수를 계산하고 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 다른 우물의 대다수에 비해 높은 결합 분수를 보여주는 우물에서 잠재적인 결합 단백질을 식별합니다.
본 대표적인 분석에서는 대부분의 우물에서 백그라운드 바인딩 신호가 상대적으로 낮은 플레이트를 관찰할 수 있다. 잘 H3에서 양성 결합 신호는 구아노신 펜타포스페이트 결합 단백질 Hpt의 과발현으로 인해 다른 우물에 대해 관찰된 것보다 훨씬 높은 결합 분획을 나타냈다. 대표 판에서, 몇몇 우물은 많은 우물에서 관찰된 상대적으로 강한 내부 점에 의해 표시된 바와 같이 상대적으로 높은 배경 결합 신호를 보여주었으며, 정량화 후에 관찰되는 일관되게 높은 결합 분획을 보였다.
특히 일부 대상은 거짓 긍정과 같은 가변 바인딩 분수도 제공했습니다. 추가 명확히 하기 위해, 연구원은 다시 결합을 시험하기 위하여 정제된 단백질을 이용했습니다. 표적 단백질이 확인되면, DRaCALA, 이더탈 적정 열량또는 다른 방법을 사용하여 상호 작용 강도 와 특이성을 균일하게 정화하고 상호 작용 강도 와 특이성을 확인할 수 있습니다.
작은 신호 분자의 표적 단백질을 식별하는 것은 인간 생물학에 세균 독성에서 나오는 역할에 대한 심층적인 이해로 가는 길을 열어줍니다.
