Küçük sinyal molekülleri bakteriyel virülansı ve insan biyolojisini kontrol etmek için çeşitli efektör proteinleri hedef alandır. Bununla birlikte, bu efektör proteinlerin tanımlanması zordur. Bir sistem biyoloji aracı olarak DRaCALA, bir OVium kütüphanesi kullanarak bilinmeyen efektör proteinlerinin uygulanabilir, hızlı ve son derece hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
DRaCALA, radyoaktif izotop veya floresan boyalarla etiketlenebildiği sürece herhangi bir küçük sinyal moleküllerini incelemek için kullanılabilir. E.coli'yi, dakikada 30 santigrat derecede ve 160 dönüşte bir gecelik inkübasyon için 96 kuyu derin kuyu plakasının her kuyusunda mililitre kloramfenikol başına 25 mikrogram ile desteklenmiş 1,5 mililitre LB'ye aşılayarak başlayın. Ertesi sabah, protein ekspresyonını teşvik etmek için 30 santigrat derecede altı saat boyunca 500 mikromoler IPTG ile gece kültürlerini tedavi edin.
Kuluçkanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletin, süpernatantı çıkarın ve örnekleri eksi 80 santigrat derecede dondurun. Lizi başlatmak için, hücreleri 37 santigrat derecede 20 dakika eritmeden önce, peletleri 150 mikrolitre liz tamponunda eksi 80 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için kuyu başına bir kez yeniden biriktirin. Lysate daha sonra kullanmadan önce eksi 80 santigrat derecede saklanmalıdır.
Hücrelerin lizizini aşırı ekspresyon proteinlerle tamamlamak için, numuneleri 40 mililitre buz soğuk lizis tamponu ikiye yeniden depolayın ve numuneleri sekiz dakika boyunca dört saniye kapalı iki saniyede% 60 genlikte sonicate edin, sonra santrifüjleme ile lizazları temizleyin. Numuneler santrifüjlenirken, ayakta duran bir polipropilen kromatografi sütununa 500 mikrolitre homojenize nikel-NTA reçinesi ekleyin. 15 dakika sonra, yerleşik reçineyi 15 mililitre ultra saf suyla iki kez ve bir kez 15 mililitre lizis tamponu iki ile yıkayın.
Santrifüjlemenin sonunda, temizlenmiş lisat süpernatantı sütuna yükleyin. Tüm lisat sütundan aktığında, sütunu 30 mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Proteinleri elüte etmek için, sütuna 400 mikroliter hacimli elution tamponu ekleyin ve işlemi üç kez tekrarlayın.
Elution tamponunun 300 mikrolitrelik hacmi daha, işlemi üç kez tekrarlamak ve eluted proteinleri 700 mikrolitrelik son bir hacimde birleştirmek için. Eluted numunenin jel filtrasyonu için, 25 mililitre taze hazırlanmış jel filtrasyon tamponu ile bir boyut dışlama sütununu yıkadıktan sonra, 500 mikrolitrelik bir döngü kullanarak eluted proteinin tüm hacmini sütuna yükleyin. Dakikada 500 mikrolitrede çalıştırın ve ilgili proteinlerin iki ila üç 500 mikrolitre hacim fraksiyonunu toplayın.
Daha sonra her proteini konsantre etmek için tek tek spin sütunlarını kullanın ve protein konsantrasyonlarını standart protokollere göre ölçmek için Bradford test kitini kullanın. Fosfor 32 etiketli guanosin pentafosfatını sentezlemek için, tabloda belirtildiği gibi vidalı bir boruda küçük ölçekli bir Relseq reaksiyonu monte edin ve reaksiyonu bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede bir saat ve 95 santigrat derecede beş dakika, ardından buzda beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkaların sonunda, çökeltilmiş proteini santrifüjleme ile aşağı çevirin ve süpernatant içeren sentezlenmiş fosfor 32 etiketli guanosin pentafosfatını yeni bir vidalı boruya aktarın.
Fosfor 32 guanosin tetrafosfat sentezi için, yeni bir vidalı kapaklı tüpte fosfor 32 etiketli guanosin pentafosfat ürününün yarısına bir mikromolar GppA ekleyin ve reaksiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika, 95 santigrat derecede beş dakika ve buzda beş dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, santrifüjleme ile çökeltiyi aşağı çevirin ve süpernatant içeren fosfor 32 etiketli guanosin tetrafosfatını yeni bir tüpe aktarın. İzole hedef proteinleri analiz etmek için, mobil faz olarak 1,5 molar monopotassium fosfat kullanarak ince bir tabaka kromatografi plakası üzerinde her numuneden bir mikroliter çalıştırın.
Analizden sonra, kurutulmuş plakayı şeffaf bir plastik klasöre yerleştirin ve bir fosfor görüntüleyicilikteki verileri görselleştirmeden ve ölçmeden önce plakayı beş dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Hedef proteinlerin DRaCALA taraması için, 95 kuyulu V tabanlı mikroter plakanın ayrı kuyularına çözülen toptan lysates'in 20 mikrolitresini ekleyin ve her kuyuya 2,5 ünite Serratia marcescens endonucleaz ekleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika sonra, lysates'i 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra, eşit hacimlerde fosfor 32 etiketli guanosin pentafosfat ve guanosin tetrafosfat karıştırın ve dört nanomoler guanosin pentafosfat çözeltisi elde etmek için karışıma 1X lizis tamponu ekleyin. Çok kanallı pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanarak, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyon için guanosin pentafosfat karışımının 10 mikrolitresini hücre lizatı ile karıştırın. Kuluçkanın sonunda, 96X pim aletini 0,01% iyonik olmayan deterjan çözeltisinde üç kez 30 saniye yıkayın, ardından pim aletini 96 kuyulu numune plakasına yerleştirmeden önce yıkama başına bir kağıt havlu üzerinde 30 saniye kurutun.
30 saniye sonra, pim aletini düz bir şekilde yukarı kaldırın ve 30 saniye boyunca bir nitroselüloz zarın üzerine yerleştirin. Beş dakika kuruduktan sonra, nitroselüloz membranını, gösterildiği gibi fosfor görüntüleme ile fosfor ekranına maruz kalma ve görselleştirme depolamak için şeffaf bir plastik klasöre yerleştirin. Potansiyel hedef proteinleri ölçmek ve tanımlamak için fosfor görüntüleyici ile ilişkili analiz yazılımında, görselleştirilmiş plakaların jel dosyasını açın.
Analiz edilecek noktaları tanımlamak için, sekiz satır ızgarasına göre 12 sütun ayarlamak üzere dizi çözümleme işlevini kullanın. Delik noktalarının dış kenarını çevrelemek için büyük daireler tanımlayın, tanımlanan büyük dairelerin hacmini artı arka planını ve alanını bir elektronik tabloya dışa aktarın. Küçük iç noktaları çevrelemek için, tanımlanan daireleri küçültün, tanımlanan küçük dairelerin hacmini ve arka planını ve alanını dışa aktarın ve tüm verileri elektronik tabloya kaydedin.
Daireleri gerektiğinde lekelerle örtüp, gerçek noktalardan biraz daha büyük olan yeniden boyutlandırmak için konumlandırın. Elektronik tablodaki bağlama kesirlerini hesaplamak ve verileri çizmek için denklemi kullanın. Daha sonra, diğer kuyuların çoğuna kıyasla yüksek bağlayıcı fraksiyonlar gösteren kuyulardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.
Bu temsili analizde, çoğu kuyuda nispeten düşük arka plan bağlama sinyallerine sahip bir plaka gözlemlenebilir. Kuyu H3'teki pozitif bağlayıcı sinyal, guanosin pentafosfat bağlayıcı protein Hpt'nin aşırı ekspresyonu nedeniyle diğer kuyular için gözlemlenenden çok daha yüksek bir bağlayıcı fraksiyon sergiledi. Temsili plakalarda, birkaç kuyu, birçok kuyuda gözlenen nispeten güçlü iç noktaların yanı sıra nicelleştirmeden sonra gözlenen sürekli olarak yüksek bağlayıcı fraksiyonlar tarafından belirtildiği gibi nispeten daha yüksek bir arka plan bağlama sinyalleri gösterdi.
Özellikle, bazı hedefler de yanlış pozitifler gibi değişken bağlayıcı kesirler verdi. Daha fazla açıklığa kavuşturmak için araştırmacılar, bağlamayı tekrar test etmek için saflaştırılmış proteinler kullandılar. Hedef proteinler tanımlandıktan sonra, DRaCALA, izotermal titrasyon kalorimetresi veya diğer yöntemleri kullanarak onları homojenliğe saflaştırabilir ve etkileşim gücünü ve özgüllüğünü doğrulayabilir.
Küçük sinyal moleküllerinin hedef proteinlerini tanımlamak, bakteri virülansından insan biyolojisine kadar ortaya çıkan rollerin derinlemesine anlaşılmasına giden yolu açmaktadır.
