Небольшие сигнальные молекулы нацелены на различные эффекторные белки для контроля бактериальной вирулентности и биологии человека. Однако эти эффекторные белки сложно идентифицировать. Как инструмент системной биологии, DRaCALA позволяет осуществимую, быструю и высокочувствительную идентификацию неизвестных эффекторных белков с помощью библиотеки OVium.
DRaCALA может быть использован для изучения любой небольшой сигнальной молекулы, если она может быть помечена либо радиоактивными изотопами, либо флуоресцентными красителями. Начните с прививки E.coli в 1,5 миллилитра LB, дополненные 25 микрограммами на миллилитр хлорамфеникола в каждой скважине из 96-луночных глубоких плит скважины для ночной инкубации при 30 градусах Цельсия и 160 оборотах в минуту. На следующее утро обработать ночные культуры 500 микромолярной IPTG в течение шести часов при 30 градусах Цельсия, чтобы вызвать экспрессию белка.
В конце инкубации гранулируют клетки центрифугированием, удаляют супернатант и замораживают образцы при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы начать лизис, повторно суспендируют гранулы в 150 микролитрах буфера лизиса по одному на лунку для 30-минутной инкубации при минус 80 градусах Цельсия перед размораживанием клеток в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Затем лизат следует хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию перед использованием.
Чтобы завершить лизис клеток с переэкспрессованными белками, повторно суспендируют образцы в 40 миллилитрах ледяного холодного лизиса буфер два и обжаривают образцы ультразвуком с амплитудой 60% через две секунды на четыре секунды в течение восьми минут, затем очищают лизаты центрифугированием. Пока образцы центрифугируются, добавьте 500 микролитров гомогенизированной никель-NTA смолы в стоячую полипропиленовую хроматографическую колонку. Через 15 минут промыть осеневшему смолу два раза 15 миллилитрами сверхчистой воды и один раз 15 миллилитрами лизисного буфера дважды.
В конце центрифугирования загрузите очищенный лисатный супернатант на колонну. Когда весь лисат пройдет через колонну, промыть колонну 30 миллилитрами промывного буфера. Чтобы элюировать белки, добавьте 400 микролитр объема буфера элюирования в столбец и повторите элюдение три раза.
Еще 300 микролитр объема элюированного буфера для повторного элюирования три раза и объединения элюированных белков в конечный объем 700 микролитров. Для гелевой фильтрации элюированного образца после промывки колонны исключения размеров 25 миллилитрами свежеприготовленного гелевого фильтрационного буфера загрузите весь объем элюированного белка на колонку с помощью петли 500 микролитров. Бегите со скоростью 500 микролитров в минуту и соберите две-три объемные доли соответствующих белков по 500 микролитров.
Затем используйте отдельные спиновые колонки для концентрации каждого белка и используйте набор для анализа Брэдфорда для измерения концентрации белка в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы синтезировать фосфор 32, меченый гуанозинпентафосфатом, соберите мелкомасштабную реакцию Relseq в трубку с винтовой крышкой, как описано в таблице, и инкубируйте реакцию в ThermoMixer в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и пяти минут при 95 градусах Цельсия, а затем пять минут на льду. В конце инкубации раскрутите осажденный белок центрифугированием и перенесите синтезированный фосфор 32, меченый гуанозинпентафосфатом, содержащим супернатант, в новую трубку с винтовой крышкой.
Для синтеза фосфора 32 гуанозин тетрафосфата добавьте один микромолярный GppA к половине меченого фосфором 32 продукта гуанозинпентафосфата в новой пробирке с крышкой и инкубируем реакцию в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия, пяти минут при 95 градусах Цельсия и пяти минут на льду. В конце инкубации раскрутите осадок центрифугированием и перенесите фосфор 32, меченый гуанозинтетрафосфатом, содержащим супернатант, в новую трубку. Чтобы проанализировать выделенные белки-мишени, запустите один микролитр каждого образца на тонкослойной хроматографической пластине, используя 1,5 молярный монокалийфосфат в качестве подвижной фазы.
После анализа поместите высушенную пластину в прозрачную пластиковую папку и подвергайте пластину люминофорной области в течение пяти минут, прежде чем визуализировать и количественно оценивать данные на люминофорном изобразователье. Для скрининга DRaCALA белков-мишеней добавьте 20 микролитров размороженных оптовых лизатов в отдельные скважины 95-луночной пластины микротитров V-нижнего дна и добавьте 2,5 единицы эндонуклеазы Serratia marcescens в каждую лунку. Через 15 минут при 37 градусах Цельсия поместите лизаты на лед на 20 минут.
Затем смешайте равные объемы фосфора 32, меченого гуанозинпентафосфатом и гуанозинтетрафосфатом, и добавьте 1X буфер лизиса один к смеси для получения четырехномолярного раствора гуанозинпентафосфата. Используя многоканальную пипетку и фильтрованные наконечники пипетки, смешайте 10 микролитров смеси гуанозинпентафосфата с клеточным лизатом для пятиминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации промыть инструмент 96X три раза в 0,01% растворе неионного моющего средства в течение 30 секунд, а затем 30 секунд сушки на бумажном полотенце за одну стирку перед помещением штифтового инструмента в 96-скважинную пробоотборную пластину.
Через 30 секунд поднимите штифт инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану в течение 30 секунд. После пяти минут сушки поместите нитроцеллюлозную мембрану в прозрачную пластиковую папку для хранения люминофорного экрана и визуализации с помощью люминофорной визуализации, как показано на экране. Чтобы количественно оценить и идентифицировать потенциальные целевые белки, в аналитическом программном обеспечении, связанном с люминофорным изобразителем, откройте гель-файл визуализированных пластин.
Чтобы определить точки для анализа, используйте функцию анализа массива, чтобы настроить сетку из 12 столбцов на восемь строк. Чтобы ограничить внешний край пятен отверстий, определите большие круги, экспортируйте объем плюс фон и площадь определенных больших кругов в электронную таблицу. Чтобы ограничить маленькие внутренние точки, размер определенных кругов, экспортируйте объем плюс фон и площадь определенных маленьких кругов и сохраните все данные в электронной таблице.
Расположите круги, чтобы перекрыть пятна по мере необходимости, изменая размер немного больше, чем фактические пятна. Используйте уравнение для вычисления связывающих дробей в электронной таблице и построения данных. Затем определите потенциальные связывающие белки в скважинах, которые показывают высокие фракции связывания по сравнению с большинством других скважин.
В этом репрезентативном анализе можно наблюдать пластину с относительно низкими фоновыми сигналами связывания в большинстве скважин. Положительный сигнал связывания в скважине H3 показал фракцию связывания, которая была намного выше, чем в других скважинах из-за сверхэкспрессии гуанозинпентафосфатсвязывающего белка Hpt. В репрезентативных пластинах несколько скважин показали относительно более высокие фоновые сигналы связывания, о чем свидетельствуют относительно сильные внутренние точки, наблюдаемые во многих скважинах, а также неизменно высокие фракции связывания, наблюдаемые после количественной оценки.
Примечательно, что некоторые мишени также давали переменные фракции связывания, такие как ложные срабатывания. Чтобы прояснить это, исследователи использовали очищенные белки для повторного тестирования связывания. Как только целевые белки идентифицированы, их можно очистить до однородности и подтвердить силу и специфичность взаимодействия с помощью DRaCALA, изотермической титруемой калориметрии или других методов.
Идентификация белков-мишеней малых сигнальных молекул прокладывает путь к глубокому пониманию ролей, возникающих из бактериальной вирулентности в биологию человека.
