该协议使我们能够轻松地浓缩和鉴定各种生物样品中微生物的挥发性代谢物和活性产生的挥发性挥发物。VASE是一种更人性化的浓缩低丰度挥发物的方法。您所需要的只是在近真空下提供一个样本，剩下的就让物理学来做。
获得临床样品的挥发性分析对于在许多不同的疾病状态下发现代谢生物标志物具有重要意义。例如，病原体驱动和感染或抗菌治疗的成功可以通过唾液，痰液或呼吸样本的挥发性分析来检测。为了制备粪便样品，在1.5毫升微量离心管中向100毫克粪便中加入一毫升去离子水并涡旋三分钟。
不使用时将样品保存在冰上。将485毫升含有20毫摩尔13C葡萄糖的BHI培养基或含有30%氘的BHI加入15微升粪便和水混合物中，确保样品的最终体积为500微升。准备技术一式三份的样品。
为了制备污水样品，将500微升污水加入500微升含有13C葡萄糖或30%氘的BHI培养基中，总体积为1毫升。准备一式三份的样品，并将它们保存在冰上。为了制备唾液样品，将50微升唾液加入500微升BHI培养基中，其中含有13C葡萄糖或30%氘，总体积为550微升。
准备一式三份的样品，并将它们保存在冰上。为了制备痰液样品，将15微升痰液加入小瓶中。准备一式三份的样品，并将它们保存在冰上。
将空的VOA小瓶放在冷板上，并将冷板放在生物安全罩中的冰上。打开 5600 SPEU 并将其调整到所需温度。使用防水标记，根据样品，重复和HSP ID标记20毫升VOA小瓶，该标记物在冰上时在小瓶外部形成冷凝时可防水。
在生物安全罩内，拧下小瓶上的白色盖子，快速将样品移液到小瓶中，然后组装盖子衬垫，黑色盖子和HSP。将含有样品和HSP的小瓶放回冷板上。在玻璃小瓶中制备完所有样品后，打开真空泵，将样品瓶置于真空状态，然后取出真空源。
使用压力表将所有样品置于真空下后，请仔细检查压力。如果小瓶泄漏，请确保盖紧紧拧紧，并且HSP和盖子衬垫的白色O形圈正确到位。将小瓶放入SPEU中以优化时间和温度，并以200 RPM搅拌。
在70摄氏度下提取培养物一小时，并在37摄氏度下用粪便，污水，唾液和痰液样品提取稳定的同种型探测实验18小时。将冷板置于零下80摄氏度，以便在提取期完成后使用。提取完成后，将样品放在冷板上15分钟，以从HSP和小瓶顶部空间抽出水蒸气，然后将HSP转移到其套管中。
在Entech软件上设置样品序列。打开程序，在仪器下拉菜单右侧的选项中选择 5800 和 序列。保存序列表，选择左侧的“运行”，如果空白 HSP 不是解吸器，则在“解吸器”中选择“从空白开始”。
请注意，HSP将由SPR处理序列中的每个样品。让 SPR 热身。允许 SPR 自动运行所有样本。
GC-MS端的序列将自动将数据记录在单独的文件中。通过选择“校准”，然后选择“外部标准化合物”下的“编辑化合物”、“名称和插入化合物”，将峰添加到处理方法中。添加化合物的名称、保留时间和量子信号目标离子。
添加三个最大的峰，其中包括概率大于75%的化合物，确保化合物的每个识别离子的排列位于峰的中心。通过选择“确定”，然后选择“方法”和“保存”来保存它。设置过程方法后，继续定量和计算，然后查看和QEDIT定量结果以定量数据。
在这里，真空辅助吸附剂提取之后，在GC-MS上进行热解吸，以调查细菌单培养物和共培养物的挥发性分布，并从人类粪便，唾液，污水和痰液样品中鉴定具有稳定同位素探测的活性挥发物。单一培养和共培养物包括细菌种类金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。在24小时和48小时的时间点从单培养物和共培养物中检测到43个注释的挥发性分子。
与氘相比，13C掺入到完全标记的挥发性分子中更多。13C掺入2-丁酮，3-羟基，2，3-丁二酮二乙酰基，乙酸和苯酚中，用于所有粪便，污水和唾液样品。丙酮、丁酸和丙酸在唾液和污水中检测为标记。
而二甲基三硫化物和二硫化物二甲基在粪便和唾液样品中均富集。挥发物1-丙醇、2-丁酮、二苯甲酮、乙醇和乙酸甲硫醇仅在污水中富集，2， 3-戊二酮在唾液中富集。氘被掺入来自唾液或污水样品的挥发物乙酸，苯甲醛，4-甲基二甲基三硫醚和苯酚中。
培养的痰液样品中醋酸、二甲基三硫醚、丙酮和丙醇2-甲基比未培养的痰液样品更丰富。对变体的排列多变异分析PERMANOVA在囊性纤维化痰液样本挥发丰度的Bray-Curtis距离基质上进行。我们发现，捐赠样本的受试者解释了13C标记培养痰中51%的变异和未培养痰中33%的变异。
在这里，显示了从七名囊性纤维化患者收集的培养痰液样本中挥发物中用13C葡萄糖进行稳定同位素标记的成功。图5A显示了大多数样品中具有较高13C掺入率的挥发物，大多数痰液样品中掺入率较低的13C百分比的挥发物显示在图5B中，少数痰液样品中转化率较低的分子显示在图5C中。约一分钟后，请务必仔细检查您的小瓶压力。
破碎的真空会破坏VASE方法的灵敏度和速度。按照这一程序，如果进行了稳定同位素探测，则可以从剩余的材料中提取DNA，以鉴定可能有助于挥发性分子产生的微生物或物种。该方法也可用于检测任何样品类型的挥发物，而无需同位素探测。
凭借灵敏度和低样品量的优点，许多应用都可以从该技术中受益。
