このプロトコルにより、さまざまな生物学的サンプル中の微生物生物から揮発性代謝産物および積極的に産生された揮発性物質を容易に濃縮および同定することができます。VASEは、低存在量の揮発性物質を濃縮するよりユーザーフレンドリーな方法です。必要なのは、ほぼ真空下のサンプルだけで、残りは物理学に任せてください。
臨床サンプルの揮発性分析へのアクセスは、多くの異なる疾患状態における代謝バイオマーカーの発見に重要な意味を持ちます。例えば、病原体の運転と感染、または抗菌療法の成功は、唾液、喀痰、または呼気サンプルの揮発性分析によって検出することができます。糞便サンプルを調製するには、1.5ミリリットルの微量遠心管内の100ミリグラムの糞便に1ミリリットルの脱イオン水を加え、3分間渦巻きます。
使用しないときは、サンプルを氷の上に保管してください。20ミリモルの13Cグルコースを含む485ミリリットルのBHI培地または30%重水素を含むBHI培地を15マイクロリットルの糞便および水の混合物に加え、サンプルの最終体積が500マイクロリットルになるようにする。技術的な3連でサンプルを準備します。
下水サンプルを調製するには、13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に500マイクロリットルの下水を加え、総容量を1ミリリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。唾液サンプルを調製するには、500マイクロリットルの唾液を13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に加え、総容量550マイクロリットルにする。
サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。喀痰サンプルを調製するには、15マイクロリットルの喀痰をバイアルに加える。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。
空のVOAバイアルをコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。5600 SPEU の電源をオンにし、必要な温度に調整します。20ミリリットルのVOAバイアルに、氷上でバイアルの外側に結露が生じた場合に備えて水に抵抗する耐水性マーカーを使用して、サンプル、複製、およびHSP IDに従ってラベルを付けます。
バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップを緩め、サンプルをバイアルに素早くピペットし、蓋ライナー、ブラックキャップ、HSPを組み立てます。サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、真空ポンプをオンにし、バイアルを真空下に置き、真空源を取り外します。
圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルが漏れている場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく固定されていることを確認してください。バイアルをSPEUに入れ、200RPMでの攪拌で時間と温度を最適化します。
培養物を摂氏70度で1時間抽出し、糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルを用いて37°Cで18時間安定アイソタイププロービング実験を抽出する。コールドプレートをマイナス80°Cに置き、抽出期間が完了した後に使用します。抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置いてHSPとバイアルのヘッドスペースから水蒸気を引き出し、HSPをスリーブに移します。
Entechソフトウェアでサンプルのシーケンスを設定します。プログラムを開き、[計測器]ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで[5800]と[シーケンス]を選択します。シーケンス テーブルを保存し、左側の [実行] を選択し、空の HSP がデソーバーでない場合は、[デソーバーで空白から開始] を選択します。
HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPR をウォームアップさせます。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにします。
GC-MS側のシーケンスは、自動的にデータを別々のファイルに記録します。処理方法にピークを追加するには、[キャリブレーション]を選択し、[外部標準化合物]の下にある[化合物の編集]、[名前]、[化合物の挿入]を選択します。化合物の名前、保持時間、および量子シグナルターゲットイオンを追加します。
75%を超える確率を持つ化合物を含む3つの最大のピークを追加し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。[OK] を選択して保存し、[方法] と [保存] を選択します。プロセスメソッドを設定したら、定量化と計算に進み、次に定量結果の表示とQEDITに進み、データを定量化します。
ここでは、真空支援吸着剤抽出に続いてGC-MS上で熱脱着を行い、細菌の単一および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した。単一および共培養は、細菌種黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクターバウマンニからなっていた。43個の注釈付き揮発性分子が、24時間および48時間の時点でモノ培養および共培養物から検出された。
重水素と比較して、完全に標識された揮発性分子への13Cの取り込みが多かった。13Cは、すべての糞便、下水、および唾液サンプルの2-ブタノン、3-ヒドロキシ、2,3-ブタンジオンジアセチル、酢酸、およびフェノールに取り込まれた。アセトン、ブタン酸、およびプロパン酸は、唾液および下水中で標識として検出された。
一方、ジメチルトリスルフィドおよびジメチルジスルフィドは、糞便および唾液サンプルの両方で富化されていた。揮発分1−プロパノール、2−ブタノン、ベンゾフェノン、エタノール、および酢酸メチルチオールは下水中にのみ富化され、2,3−ペンタンジオンは唾液中に富化された。重水素は、唾液または下水サンプルのいずれかから揮発性酢酸、ベンズアルデヒド、4-メチルジメチルトリスルフィド、およびフェノールに取り込まれた。
酢酸、三硫化ジメチル、アセトン、およびプロパノール2-メチルは、培養喀痰サンプルよりも培養喀痰サンプル中に多く含まれていた。変異体であるPERMANOVAの順列多変量解析を、嚢胞性線維症喀痰サンプルからの揮発性存在量のBray-Curtis距離行列について実施した。サンプルを寄贈した被験者は、13C標識培養喀痰の変動の51%、未培養喀痰の変動の33%を説明していることがわかりました。
ここでは、嚢胞性線維症を有する7人から採取した培養喀痰試料からの揮発分中の13Cグルコースによる安定同位体標識の成功が示される。大多数のサンプルについてより高い13Cの取り込みを有する揮発性物質をパネル5Aに示し、大多数の喀痰サンプルにおいてより低いパーセントの13Cの取り込みを有するものをパネル5Bに示し、そして少数の喀痰サンプルにおいてより低い13Cパーセントの変換を有する分子をパネル5Cに示す。常に約1分後にバイアルの圧力を再確認してください。
真空が壊れると、VASE法の感度と速度が損なわれます。この手順に続いて、安定同位体プロービングが実施された場合、残りの材料からDNAを抽出して、揮発性分子の産生に寄与した可能性のある微生物生物または種を同定することができる。この方法は、同位体プロービングなしで任意のサンプルタイプから揮発性物質を検出する場合にも有用である。
感度とサンプル量が少ないという利点により、多くのアプリケーションがこの手法の恩恵を受けることができます。
